生物技术制药第八章 利用现代生物技术改造传统制药工业.ppt

1、第八章 利用现代生物技术改造传统制药工业,现代生物技术不仅直接提供IFN、IL、EPO、CSF等基因工程药物，也广泛用于改造抗生素和生物制品等传统医药工业。主要体现在以下几个方面 抗生素：可从产生菌中分离出生物合成酶基因，进行克隆，提高生产菌 的生物量，或得到新的杂合抗生素 氨基酸：利用生物技术得到基因克隆的生产菌，或采用融合技术提高氨 基酸产量 维生素：构建基因工程菌，简化维生素的生产工艺（如Vit C） 疫苗：利用基因工程技术将抗原克隆到E.coli或酵母中，用工程菌生产 疫苗，产量高、工艺简单、操作安全,概 述,第一节 基因工程在抗生素生产中的应用,抗生素生物合成并非单一基因的直接产物，

2、而是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成过程是一个复杂的、多因素调节的过程 传统的提高微生物产生抗生素能力的方法主要是用诱变剂（如紫外线、化学诱变剂等）处理微生物，获得生产能力较高的突变株。80年代，人们开始将DNA重组技术应用于次级代谢产物的生物合成上；通过生物合成酶基因的分离、质粒的选择、基因重组与转移、宿主表达等方面,一、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,1.抗生素（链霉素）生物合成基因的结构特点 链霉菌抗生素生物合成基因组的一个典型特性是G-C碱基组成， （G+C）%高达70%以上；且三联体密码子中第3个碱基G、C比例极高 抗生素生物合成基因大多处于一个基因族中

3、抗生素生物合成基因除定位在染色体上外，有的定位于质粒上,2.克隆抗生素生物合成基因的策略和方法,在标准宿主系统中克隆检测单基因产物 阻断变株法 突变克隆法 直接克隆法 克隆抗生素抗性基因法 寡核苷酸探针法 同源基因杂交法,在标准宿主系统中克隆检测单基因产物,鸟枪克隆法：这是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方 法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离

4、、回收。这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法 利用鸟枪克隆法，把抗生素产生菌DNA克隆到最常用的宿主变青链霉菌中，通过检测宿主菌中个别基因产物，筛选克隆，从而分离到相应的基因,阻断变株法,通过一系列阻断变株的互补结果来确定被克隆DNA片段的性质。即首先经诱变获得一系列生物合成阻断变株（不能合成抗生素），用互补共合成法来确定这些变株在生物合成途径中的相互位置

5、。从野生型菌株中分离DNA，与载体连接后转入阻断变株，以抗生素表型的恢复作指标，克隆生物合成不同阶段的酶基因,突变克隆法,利用整合质粒或噬菌体，将原株DNA转入到抗生素产生菌中。由于基因有同源性，有可能发生基因重组，一旦某DNA片段的插入干扰了原株某个生物合成基因的转录，即得到这个生物合成基因的阻断变株，其相应的DNA片段就是这个阶段的生物合成基因 此法由于要利用噬菌体，因而有一定局限性,直接克隆法,将抗生素产生菌的部分酶切的bp的片段连接到质粒的表达位点上，转化变青链霉菌，培养，筛选具有抗菌活性转化子 由于抗生素生物合成基因往往成族存在，使得有时可能需要克隆整套生物合成基因。故此法主要用于基

6、因族相对较小（30kb）的抗生素生物合成基因,克隆抗生素抗性基因法,抗生素生物合成基因和抗性基因往往是连锁的，表达也是协同的（否则菌体本身没有抗性，容易被自身所产生的抗生素杀灭），且抗性基因一般只有kb，容易检测于克隆 先将抗性基因克隆到标准宿主或产生菌的敏感突变株中，再分析与之紧密连锁的，就可能找到生物合成基因；也可利用已经克隆的抗性基因作为探针，从产生菌基因文库中分离与之同源的并带有生物合成基因的片段,寡核苷酸探针法,根据抗生素生物合成酶基因的氨基酸序列，推导出其基因序列，然后人工合成寡核苷酸，并以此寡核苷酸作为探针，从基因文库中克隆出相应的生物合成基因,同源基因杂交法,利用一种已经克隆的

7、抗生素生物合成基因片段为探针，探测相关抗生素同源基因，最后分离及克隆抗生素生物合成基因,二、提高抗生素产量,在抗生素生产过程中，获得高产菌株的传统方法是通过诱变育种得到的；而利用基因工程技术提高抗生素产量应从以下方面着手 1.将抗生素产生菌基因随机克隆到原株直接筛选高产菌株 原理：在克隆菌中，增加某一与产量有关的基因（限速阶段的正性调 节基因）的剂量，使产量提高,2.增加参与生物合成限速阶段基因的拷贝数,抗生素生物合成途径中的某个阶段可能是整个合成中的限速阶段，识别合成途径中的“限速瓶颈”，并设法导入能提高此阶段酶系的基因拷贝数；只要增加的中间产物不对合成途径中的某步骤产生负反馈抑制，就可以增

8、加抗生素的产量。故增加生物合成中限速阶段酶基因剂量有可能提高抗生素产量,3.通过调节基因的作用,调节基因的作用可增加或降低抗生素的产量，它常常是抗生素生物合成和自身抗性基因族的组成部分。正性调节基因可加速抗生素的合成，负性调节基因可降低抗生素的产量。因此，增加正性调节基因或降低负性调节基因也是增加抗生素产量的方法,4.增加抗性基因,抗性基因通过其产物灭活胞内或胞外的抗生素，保护自身免遭抗生素的杀灭作用；而且有些抗性基因的产物还直接参与抗生素的合成。抗性基因经常与生物合成基因连锁，是激活生物合成基因进行转录的必需成分。抗性基因必须先进行转录，建立抗性后，生物合成基因的转录才能进行。抗生素的生产水

9、平是由抗生素生物合成酶与对自身抗性的酶所共同确定,三、改善抗生素组分,许多抗生素产生菌可以同时产生多种抗生素，这些组分的化学结构和性质非常相似，而其生物活性有时却相差很大 随着对各种抗生素生物合成途径的深入了解及基因重组技术的发展应用基因工程技术可定向改造抗生素产生菌，获得只产生有效成分的菌种,四、改造抗生素生产工艺,1.抗生素产生菌一般对氧供应较敏感，供氧不足往往是高产发酵的限制 因素。在培养过程中，进入液相培养基的氧分子需穿过几层界膜，进 入菌体后，再经物理扩散，才能到达相应的呼吸细胞器。若在菌体内 导入血红蛋白基因，提高呼吸细胞器对溶氧的亲合力，从而提高细胞 对溶氧的利用率 2.在抗生素

10、产生菌中引入耐高温的调节基因，或耐热的生物合成基因， 可使发酵温度提高，降低生产成本,六、产生杂合抗生素,杂合抗生素：应用遗传重组技术改造菌种，产生新的工程菌，制备的新型抗菌活性化合物 1.不同抗生素生物合成基因重组 2.生物合成途径中某个酶基因的突变 3.在生物合成途径中引入一个酶基因 4.利用底物特异性不强的酶催化形成新产物,第二节 基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用,一、在氨基酸生产中的应用,1.在酶法生产方面，主要通过克隆某些酶系基因来生产氨基酸 如 在L-Trp生产中，利用色氨酸合成酶基因和丝氨酸转羟甲基酶基因的重组质粒，在E.coli中克隆化;可使L-Trp产量高达9g/L 2.在利用转氨酶反应生产氨基酸方面，将相应的转氨酶基因克隆到工程菌中,二、在维生素生产中的应用,简化维生素的发酵工艺 如 Vit.C的传统生产工艺为“两步发酵法”。如今可将第二步发酵菌株中与发酵生产Vit.C相关的基因转移至第一步菌株中，构建成新的工程菌株，这样Vit.C的生产过程只需一步发酵即可完成,第三节 基因工程在生物制品