糖代谢相关检验.ppt

1、b,1,第九章 糖代谢相关检验,学习内容,第一节 血糖测定,第二节 血清糖基化蛋白测定,第三节 胰岛素释放及C肽释放试验,第四节 糖代谢产物测定,第五节 其他糖测定,学习目标,掌握血糖及口服糖耐量试验的概念、实验原理、操作方法及临床应用；掌握糖化血清蛋白测定的原理、方法学评价及临床应用,熟悉胰岛素及胰岛素释放试验的临床应用；熟悉C-肽及C-肽释放试验的临床应用。,了解血乳酸、丙酮酸、-羟丁酸及其他糖的测定。,能规范、熟练地进行血糖测定、口服糖耐量试验、糖化血红蛋白和糖化血清蛋白的测定，并正确解释实验结果,糖是一类化学本质为多羟醛或多羟酮及其衍生物的有机化合物，糖代谢（carbohydrate

2、metabolism）指葡萄糖(glucose，Glc)、糖原(glycogen，Gn)等在体内的一系列复杂的化学反应。 在人体内糖的主要形式是葡萄糖(glucose，Glc)及糖原(glycogen，Gn)。葡萄糖是糖在血液中的运输形式，在机体糖代谢中占据主要地位；糖原是葡萄糖的多聚体,包括肝糖原、肌糖原和肾糖原等，是糖在体内的储存形式。葡萄糖与糖原都能在体内氧化提供能量。,前言,临床常用检测试验：血糖浓度测定，口服葡萄糖耐量试验，糖化血红蛋白测定，糖化血清蛋白测定，胰岛素及胰岛素释放试验，C-肽及C-肽释放试验，糖代谢产物（血乳酸、丙酮、-羟丁酸）测定，其他糖（果糖、半乳糖）测定等。,b,

3、6,第一节 血糖测定,血糖一般指血液中的葡萄糖。在激素等因素的调节下，血糖浓度保持相对恒定。 健康人群空腹血糖的参考范围通常为3.896.11mmol/L（70110mg/dl），但2003年美国糖尿病协会（ADA）建议下调参考范围上限为5.6mmol/L（100mg/dl）。,血糖,血糖浓度取决于血糖的来源及去路的动态平衡。血糖的来源主要受机体进食的影响，而去路则取决于机体对血糖的利用。,一、糖代谢概述,根据机体所处的不同状态，血糖主要有三个来源： 1食物中糖类的消化吸收 2糖原的分解 3非糖物质的转化,（一）血糖的来源,葡萄糖的代谢过程根据机体的需要而定，主要代谢去路有： 1有氧氧化 2合

4、成糖原 3转换为非糖物质 4转换为其他糖类衍生物 5生成尿糖,（二）血糖的去路,血糖的来源与去路,血糖如何维持稳定？ 关键酶调节 关键酶如何调节 激素调节 常见的升高血糖的激素 胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素 常见的降低血糖的激素 胰岛素,二、血糖浓度的调节,定义：胰岛素（insulin）是由胰岛细胞合成分泌的多肽激素。它主要作用于肝脏、骨骼肌和脂肪组织。 功能：一方面促进这些组织细胞摄取葡萄糖，并转换成糖原或脂肪贮存；另一方面抑制肝脏的糖原分解和糖异生，从而降低血糖。,（一）降低血糖的激素胰岛素,定义 功能,化学构成 人胰岛素含51个氨基酸残基，分子量5808，由A、B两条链组成，含两个链

5、间二硫键和一个链内二硫键。人胰岛素有别于其他生物的胰岛素，但其B链的C末端（B23B26）具有高度保守性，是胰岛素生物学活性的决定性区域，故不同来源的胰岛素在免疫学和生物学活性上有相似性,（一）降低血糖的激素胰岛素,合成过程 首先在胰岛细胞的核糖体上合成含100个氨基酸残基的前胰岛素原（preproinsulin）。 前胰岛素原很快被酶切去信号肽，生成86个氨基酸的胰岛素原（proinsulin）。 最后胰岛素原通过蛋白酶作用，切掉4个氨基酸残基，水解为51个氨基酸的胰岛素和31个氨基酸的C-肽（C-peptide）。,（一）降低血糖的激素胰岛素,（一）降低血糖的激素胰岛素,前胰岛素原 （pr

6、eproinsulin）,胰岛素原 （proinsulin）,胰岛素 （insulin）,C-肽 （C-peptide）,释放 激动剂：葡萄糖、氨基酸、胰腺、胃肠激素等。 阻断剂：高血糖、生长抑素和-肾上腺素能。,（一）降低血糖的激素胰岛素,胰岛素主要为肝脏摄取并降解，少量由肾小球滤过，并在近曲小管重吸收和降解。胰岛素在体循环中的生物半寿期为45min。 主要通过胰岛素和胰岛素受体的结合，触发细胞内特异性的信号转导，从而产生相应的生物学效应。,（一）降低血糖的激素胰岛素,降解 作用机制,胰岛素样生长因子（insulin like growth factors， IGF）是一种多肽，与胰岛素的结

7、构相似，具有类似于胰岛素的代谢作用和促生长作用，主要有IGF I和IGF II。IGF I又称生长调节素C（somatomedin C），是细胞生长和分化的主要调节因子之一，而IGF II的生理作用尚不清楚。IGF I主要由肝脏产生，其他许多阿组织也可合成IGF I，但不入血，仅在局部发挥作用。血液中，IGF浓度约比胰岛素高1 000倍，但绝大部分与特异性蛋白质结合，仅少量以游离形式存在。而胰岛素在血液中全部是游离的，因此相比胰岛素，血液中IGF的活性很低。IGF通过特异性的IGF受体或胰岛素受体而发挥作用。,（一）降低血糖的激素 胰岛素样生长因子,IGF I在正常糖代谢中的作用尚不清楚，外源

8、性注入可导致低血糖，而IGF I缺乏可引起生长迟缓。胰腺外肿瘤可致IGF的生成过量，患者可有饥饿性低血糖。测定IGF I浓度可评价生长激素的缺乏和过量，监测机体的营养状况。,（一）降低血糖的激素 胰岛素样生长因子,胰高血糖素和肾上腺素,（二）升高血糖的激素,刺激葡萄糖释放,减少葡糖糖利用,生长激素和皮质醇,血糖的激素调节,b,23,如果调节失衡，结果是什么？,高血糖或者低血糖 低血糖：低于2.8 mmol/L。 高血糖：高于7.1 mmol/L（高于8.89 mmol/L，出现糖尿）。 最常见病理性高血糖：糖尿病。,高血糖症与糖尿病,高血糖症（hyperglycemia）是糖代谢紊乱导致血糖浓

9、度高于参考上限的一种异常现象，主要表现为空腹血糖损伤、糖耐量减退或糖尿病。其中，空腹血糖损伤和糖耐量减退是正常糖代谢与糖尿病之间的中间状态，皆系发展为糖尿病及心血管病变的危险因子和标志，而糖尿病是一组严重的代谢性疾病。,糖尿病的发病机制与分型,糖尿病（diabetes mellitus, DM）是一组由于胰岛素分泌不足或/和胰岛素作用低下而引起的糖代谢紊乱性疾病。 分型：型糖尿病、型糖尿病 临床症状:“三多一少”，即多尿、烦渴、多饮和体重减轻。,b,26,型糖尿病 又叫青年发病型糖尿病或胰岛素依耐型糖尿病。 原因：胰腺产生胰岛素的细胞已经彻底损坏,从而完全失去了产生胰岛素的功能. 治疗：依赖胰

10、岛素治疗。,型糖尿病 又叫非胰岛素依耐型糖尿病。 原因：自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素无法发挥作用。 治疗：需要胰岛素单独或与口服药联合应用的治疗,b,27,测定方法 无机化学法 有机化学法 酶法 参考范围 3.9 - 6.1 mmol/L (70 110 mg/dL) 临床意义 高血糖症 低血糖症,三、血清（浆）葡萄糖测定与评价,原理葡萄糖在和碱性铜试剂混合加热后，可使 Cu2+还原成Cu+ ，后者与磷钼酸试剂作用生成蓝色的钼蓝。通过比色法测定蓝色化合物，计算出血糖的含量 特异性差、易受其他还原性物质的干扰，现已淘汰 空腹正常血糖参考值 4.4 - 6.7mmol/L或

11、80-120mg/dL,无机化学法：Folin-Wu法,b,30,有机化学法：邻甲苯胺法,原理： 葡萄糖为一含醛基的已糖，在酸性条件下加热，可脱水生成5-羟甲基-2-呋喃甲醛，后者与邻甲苯胺缩合成青色的Schiff碱。 Schiff碱颜色的深浅与样品中葡萄糖的含量成正比。 评价：操作简便，特异性高，操作简便，可直接采用血浆或血清进行测定，但其使用的试剂具有腐蚀性和致癌性，现应用较少。,酶法,葡萄糖氧化酶(GOD)法,己糖激酶(HK)法,葡萄糖脱氢酶法,国际公认,国家推荐,实验 9-1葡萄糖氧化酶（ glucose oxidase, GOD）法测定血糖,原理：葡萄糖氧化酶利用氧和水将葡萄糖氧化为

12、葡萄糖酸，并释放过氧化氢。 过氧化氢在过氧化物酶 (peroxidase，POD)作用下，分解为水和氧的同时将无色的4-氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色的醌类化合物。 红色的深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比，在510nm波长处测定吸光度，与标准管比较可计算出血糖的浓度。,试剂准备 磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L, pH7.0） 酶试剂 葡萄糖氧化酶1200U，过氧化物酶1200U，4-氨基安替比林10 mg ，溶于上述磷酸盐缓冲液80 mL中，调pH7.0，定容至100 mL，2-8保存，可保存3个月 酚溶液 重蒸馏酚100 mg溶于100 mL蒸馏水中，避光、 2-8保存，可保存1个月

13、苯甲酸溶液（12 mol/L） 葡萄糖标准液（5.0 mmol/L ）,b,34,实验操作,混匀，置 37 水浴保温 15分钟，每管加蒸馏水0.5 ml，在510nm波长处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。根据各管吸光度计算其血糖浓度。 结果计算,取3支试管，按下表操作,葡萄糖含量 （mmol/L）,b,35,自动化分析仪检测,试剂 主要成分与手动检测类似，见试剂盒说明书。 工作液配置：根据标本量，临时将酶试剂与缓冲液按照1:4比例混匀。 操作 定标、质量控制、标本上机 结果计算 1 mg/dL X 0.0555=0.0555 mmol/L,b,36,葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液的葡萄糖含

14、量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。这是因为尿液中的尿酸等干扰物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。 对于血液样品需及时分离红细胞。因为红细胞的酵解将会导致测定结果偏低。建议测定样品以草酸钾-氟化钠为抗凝剂以抑制糖酵解。,注意事项,b,37,严重黄疸、溶血及乳糜样血清先制备无蛋白血滤液，然后在进行测定。 酶酚混合液一般现用现配。 葡萄糖氧化酶对 - D 葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约 36% 为 型， 64% 为 型。葡萄糖的完全氧化需要 型到 型的变旋反应。葡萄糖变旋酶，可加速这一反应，延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。新配制的葡萄糖标准液主要是 型，故须放置 2h 以上

15、( 最好过夜 ) ，待变旋平衡后方可应用。,注意事项,b,38,计算：,葡萄糖标准液：5 mmol/L 血清葡萄糖（mmol/L）=AT/AS CS,参考值：,3.96.1 mmol/L,b,39,本法测定葡萄糖非常特异，从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。误差往往发生在反应的第二步。一些还原性物质如尿酸、维生素 C 、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。但是对测定结果无显著影响。,实验误差分析：,实验 9-2己糖激酶（HK）法测定血糖,原理：,NADPH在340nm有吸收峰，其吸光度增加与标本中

16、的葡萄糖浓度成正比。,评价： 本法特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化分析，为葡萄糖测定的参考方法，但是试剂较贵。,试剂盒配方,b,42,实验操作,（2）混匀，置 37 水浴保温 10分钟，在340nm波长处比色，比色皿光径1 cm、以蒸馏水调零，读取各管吸光度。根据各管吸光度计算其血糖浓度。 （3）结果计算,1）终点法 （1）按下表操作,b,43,实验操作,2）速率法 以半自动生化分析仪为例 （1）主要参数如下 系数8.2 孵育时间30s 监测时间60s 波长340nm 比色皿光径1.0cm 温度37 吸液量0.5mL （2）加样 （3）结果计算 血清葡萄糖（mmol/L）=(A/T

17、)8.2,注意事项及评价,试剂要求：各工具酶均需高纯度产品。 准确度及精密度较高，适用于自动分析仪，但试剂较贵。 己糖激酶法测定血糖不收轻度溶血、脂血、黄疸、尿酸、维生素C等干扰，但严重溶血的标本会影响测定结果。罕见病症病例，特别是IgM型中，血液葡萄糖测定结果不可靠。,b,45,不同检测方法所提供的空腹正常血糖参考值存在差异。 葡萄糖氧化酶法：3.96.1mmol/L Folin-Wu法：4.46.7mmol/L 邻-甲苯胺法：3.96.1mmol/L,b,46,葡萄糖氧化酶法：该法特异性高，反应条件温和，能反映血中葡萄糖的真实含量，且已推广出试剂盒，广泛应用与临床。 己糖激酶法：特异性高，灵敏度高，干扰因素少，适用于自动化分析，为葡萄糖测定的参考方法，但是试剂较贵。 Folin-Wu法：该法对葡萄糖无特异性，一切还原物质均可产生同样的反应。 邻-甲苯胺法：该法涉及强酸、加热等反应条件，不便于大规模检测，且邻甲苯胺须蒸馏后使用，有毒性，临床和科研上已很少采用。,血糖测定方法特点,测定方法 无机化学法 有机化学法 酶法 参考范围