RNA的选择性剪切.ppt

1、b,1,RNA的选择性剪切,以NRDR 的选择性剪切为例,汕头大学医学院,b,2,概论,知识背景 RNA的剪切修饰 RNA的选择性剪切 NRDR,b,3,知识背景（1）,生物的复杂性与其基因组基因数量似乎存在明显差异 物种间，脊椎动物的相对应的DNA序列有着惊人的相似。,b,4,选择性剪切（alternative splicing）是物种进化重要方式之一。 Neuropsin是一种主要在大脑海马区表达的丝氨酸蛋白酶。该基因同学习和记忆的功能调节以及大脑的发育相关。研究发现，小鼠仅表达 TypeI蛋白酶,检测的猕猴、滇金丝猴和长臂猿的大脑中也只表达Type-I。在人的胚胎中，TypeI和Type

2、II两种剪切方式都有表达，且丰度相似。在成人脑中，TypeII蛋白酶成为优势表达的蛋白酶，TypeI仅有少量表达。研究发现TypeII只在人的大脑中表达。,知识背景（2）,b,5,RNA的剪切修饰,Genome,Transcriptome,Proteome,DNA,RNA,Protein,b,6,Intergenic,Intergenic,Gene,Exon,Intron,Exon,Exon,Intron,Transcription of pre-mRNA,GT,AG,AG,GT,Exon,Exon,Exon,Splicing to mRNA,5,5,5,3,3,3,Donor Site,Ac

3、ceptor Site,U1,U2,Genome:,Transcriptome:,RNA的剪切修饰,b,7,RNA的剪切修饰,过去人们一直认为，基因的遗传密码子是连续不断地并列在一起，形成一条没有间隔的完整的基因体。但以后通过对真核蛋白质编码基因结构的分析发现，在它们的核苷酸序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。我们称这种编码序列不连续的间断基因为断裂基因。 在很多情况下，有内含子的基因首先转录成RNA 前体，之后内含子被去除，外显子被拼接到一起。成熟的mRNA只含有外显子序列。 我们把内含子的删除过程称为RNA的剪接,b,8,通过对mRNA序列与结构

4、基因核苷酸序列的比较，我们可以确定外显子与内含子的接合点。发现，在一个内含子的两端并不存在广泛的相似性或互补性。然而，接点还是具有很好的保守性，尽管只是短短的一致序列。 数字指示了特定的碱基在每个一致性位点存在的百分比。结果只在内含子接点上有高一致性序列发现。这样，基因内含子序列就可以定义为：GTAG 因为把内含子定义成从双核苷酸GT开始到双核苷酸AG结束，所以接点经常被描述为遵守GT-AG法则，RNA中实际的序列为GU-AG法则。 GT-AG法则可以描述许多真核生物核基因中的剪接点。并不适用于线粒体中的内含子，也不适用于酵母的tRNA基因,b,9,RNA的剪切修饰,第一阶段，在内含子5端剪接

5、点形成一个切口，左边的外显子以直线形式存在，右边的内含子一外显子则开成索套（这里内含子5端和内含子内一个碱基形成5-2键，这个目标碱基为腺苷，被称为分枝点）。 第二阶段，3端剪接点的剪切从索套形式中释放了内含子，同时，右边的外显子和左边的外显子连接起来。 第三阶段，索套随即脱离分枝点，形成一个线性的删除内含子，然后很快被降解。,b,10,RNA的剪切修饰,b,11,RNA的剪切修饰,b,12,RNA的选择性剪切,概念 选择性剪切是指从一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程。 选择性剪切不仅仅是mRNA剪去内含子的过程，还包括不同外显子之

6、间的组合过程,b,13,RNA的选择性剪切,1980年 Baltimore在小鼠 IgM 基因发现第一个选择性剪接现象，不同外显子组合分别产生膜型、分泌型IgM。 高通量的基因组测序和EST测序，使生物信息学方法来研究选择性剪接成为可能。最近研究结果显示，约35%60%的人基因有选择性剪接形式。,b,14,选择性剪接是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要机制。 选择性剪接可以从一个基因产生多种蛋白，从而使蛋白质组中蛋白质的数量超过基因组中基因的数量。其中，从影响基因的数量和生物种类范围来看，选择性剪接是扩大蛋白质多样性的最重要的机制,b,15,RNA的选择性剪切,二 单个基因选择性剪接的方式

7、 1. 内含子的保留； 2. 可变外显子的保留或切除； 3. 3和5剪接位点的转移（shift）导致外显子的增长或缩短。,b,16,RNA的选择性剪切,pre-mRNA,GT,3,5,AG,b,17,三、选择生剪接的功能和生物学意义 1. 选择性剪接是在RNA水平调控基因表达的机制之一。 2. 选择性剪接使生物表型具有多样性与复杂性。,RNA的选择性剪切,b,18,NRDR的选择性剪切,全反式维甲酸 (aRA) 通过与其在核内受体结合调节基因的转录来发挥其重要的生理功能，包括正常胚胎的发育，形态、神经系统的形成，成体动物的生长，发育，繁殖等， 并通过调节组织及细胞的分化来促使一些恶性肿瘤向良性

8、转变。临床上我国科学家率先将aRA用于急性早幼粒细胞白血病的治疗并取得了良好的疗效。aRA在体内是由维生素A也称视黄醇(Retinol)经两步代谢而成，中间代谢产物为视黄醛(Retinal)， 即 Retinol Retinal aRA,b,19,NRDR的选择性剪切,已有不同组织的多种酶被认为参与这两步代谢过程。辅酶II依赖性视黄醇脱氢酶(NADP-dependent retinol dehydrogenase/ reductase，NRDR)是由黄东阳教授在兔肝细胞中纯化的一种新酶， NRDR普遍存在于哺乳动物肝中，显示出较强的Retinol氧化与Retinal还原活性。 兔、小鼠、人与牛

9、肝脏NRDR cDNA全长已相继被克隆（GenBank登录号为AB045133，AB045132，AB045131，AF487454），这些NRDR的C-末端都有过氧化物酶体定位信号-SRL，属于短链脱氢酶/还原酶家族（SDR）。预测这些cDNA编码区序列（ORF），发现它们均有两个ORF，分别编码278与260个氨基酸，后者符合Kozak序列。,b,20,NRDR的选择性剪切,人NRDR基因位于14号染色体长臂(14q11.2, LOCUS NT_025892)，被命名为DHRS4，由3个外显子簇（clusters），共97634碱基组成。Cluster 1 是人与哺乳动物共有的保守序列，含

10、有构成NRDR的8个外显子，Cluster 2含有8个，Cluster 3含有7个相对应的外显子。,b,21,人DHRS4基因结构、NRDR及其选择性剪切亚型的构造特点,b,22,NRDR的选择性剪切亚型,最近，在人宫颈癌细胞、肝癌细胞及食管癌细胞中均发现新的NRDR剪切亚型 。 近年来，选择性剪切对于蛋白质多样性及其与肿瘤的相关性引发人们关注。作为参与合成、调节aRA的NRDR，出现不同形式的剪切亚型，是否与肿瘤的发生有相关性，值得深入研究。,b,23,NRDR的选择性剪切亚型,一 NRDR选择性剪切亚型的克隆 1.提取细胞总RNA: Trizol 法提取Hela, BELT, EC7-97

11、06总RNA 2.逆转录为cDNA 3.PCR扩增： NRDR sense:5-tccaccgacgggatcggctt-3 NRDR antisense:5-atgccagcacaatcctctggct-3 NRDR iso sense:5-atggccagctccgggatga-3 NRDRiso antisense:5-tcagaggcgggacggggtt-3 4.胶回收：PCR产物纯化 5.连接至质粒载体： pGEM-T easy 载体 6.转化至感受态大肠杆菌（JM109） 7.重组子筛选（蓝白筛选） 8.细菌扩大培养 9.提质粒 10.测序,b,24,NRDR的选择性剪切亚型,二

12、 选择性剪切亚型全长cDNA的克隆 Invitrogen 3RACE试剂盒 cDNA 合成引物:5-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTT TTTTTTT TTTTTTT-3 First PCR sense:5-tccaccgacgggatcggctt 3 AUAP: 5-GGTGTGGGACAAGAGGCG-3 Nested PCR sense: 5-tggtggccacgactctggacat-3 AUAP: 5-GGTGTGGGACAAGAGGCG-3 Invitrogen 5RACE试剂盒 cDNA 合成引物：5-GCAGGAATCCCGAGT-3 First PCR AAP:

13、 5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC GGGIIGGGIIGGGIIG-3 antisense: 5-tcttatccgcagggtttcttt-3 Nested PCR AUAP:5-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3 antisense: 5-catccagagaggagatggactg-3,b,25,NRDR的选择性剪切亚型,三 选择性剪切亚型的细胞内定位 将新的选择性剪切亚型基因与水母绿色荧光蛋白（GFP）基因融合，在哺乳动物细胞中表达，并用相应的抗体及荧光标记二抗进一步确认其在细胞内的位置。 四 新的选择性剪切亚型的体外重组表达 原核表达，真核表达 蛋白经分离、纯化后，测定其功能 五 制备抗体，检测肿瘤组织中新亚型的蛋白表达,b,26,NRDR的选择性剪切亚型,Hela, BELT, EC9706细胞株中发现新的剪切亚型,b,27,NRDR的选择性剪切亚型,b,28,NRDR的选择性剪切亚型,b,29,NRDR的选择性剪切亚型,b,30,NRDR的选择性剪切亚型,预测新剪切亚型蛋白仍保留了部分SDR结构功能域，在20-27位氨基酸(TASTDGIG)