纤维素酶活力的测定

1、-糖苷酶活力的测定（CMC）一 目的：掌握CMC酶活力测定纤维素酶的原理及测定方法。 原理：纤维素酶能从底物羧甲基纤维素钠（CMC-Na）中分解出还原糖，还原糖又同3，5-而硝基水杨酸发生反应，产生一种黄橙混合色，用分光光度计可测定其色度，计算酶活力。二 试剂：13，5-而硝基水杨酸显色剂（又称DNS试剂）： 称取10g3,5-而硝基水杨酸，溶于蒸馏水中，加入20g分析纯NaOH，200g酒石酸钾钠，加税500ml,升温溶解后，加入重蒸酚2g,无水亚硫酸钠0.5g,加热搅拌，待全部溶解后，定容至1000ml。贮存于棕色瓶中，室温保存，放置一周后使用。20.1mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓

2、冲液：称取结晶醋酸钠（CH3COONa.3 H2O）13.61g，醋酸（CH3COOH）6.00g，用蒸馏水溶解，并定容至1000 ml，配好后用pH计矫正。31mg/ml葡萄糖标准溶液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在70、600nm汞柱下干燥5h至恒重），用少量蒸馏水溶解并定容至100ml，冰箱中保存备用。4代测酶液：称取酶粉1.0g（或吸取酶液1.00ml），先用少量的0.05mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清液小心倾入适当的容量瓶中，沉渣部分再加上述缓冲液溶解，如此反复捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，40水浴锅中浸提1

3、h，用四层纱布或脱脂棉过滤，滤液供测定用。5底物：0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液，配制方法为城区0.5000g羧甲基纤维素钠（Sigma公司生产），准确至0.001g,用上述缓冲液溶解定容至100ml,冰箱中保存，有效期3d。三 仪器：分析天平、变温电炉、恒温水浴锅、分光光度计、秒表等。四 方法步骤：1 标准曲线的绘制 分别吸取0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4ml的1mg/ml葡萄糖液于7支20ml的比色管中，分别用蒸馏水补充体积至2.oml,各加3，5-而硝基水杨酸1.5ml,在沸水浴中煮沸5min，冷却后分别用蒸馏水定容至20ml，摇匀。以2m

4、l蒸馏水加DNS溶液1.5ml,按上述同样操作为空白调零，在540nm处比色。标准曲线绘制个试管所含物质的体积见下表。以吸光度A值为纵坐标，葡萄糖毫克数W(mg)为横坐标绘制出标准曲线（理论上此线应过原点）。标准曲线绘制各试管所含物质的体积管号空白1234567葡萄糖液/ml 00.20.40.60.81.01.21.4蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.00.80.6 DNS/ml1.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖量/mg00.20.40.60.81.01.21.42 酶样测定取20ml比色管1支，加入0.5mol/L pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液1.5ml和6

5、小片1cm1cm滤纸后，再加适当稀释的酶液0.5ml,于40下保温1h后，再加适当稀释的酶液0.5ml，于40下保温1h后，加DNS液1.5ml,在沸水煮沸5min显色，流水冷却，用蒸馏水定容至20ml,摇匀；另取一支试管，加缓冲液和滤纸后，先加DNS液，再加缓冲液0.5ml,同样显色、冷却、定容作为空白，在波长540nm比色，测定A值，查标准曲线得出相应的葡萄糖含量W。五 计算酶的比活力定义：在40，pH4.5条件下，每小时催化滤纸产生相当于1ug分子葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位，以U/g表示。 W1000n X = - 0.518030式中，X-样品酶的活力，U/g(ug/ml); W-查标准曲线得出