微生物代谢控制发酵(第三章)

1、微生物代谢控制发酵,王 腾 飞 wangtengfei1981第三章 微生物代谢控制发酵,第一节 代谢控制发酵的基本思路 第二节 微生物代谢控制发酵的措施 第三节 环境条件的控制,第一节 代谢控制发酵的基本思路,应用营养缺陷型突变株切断代谢支路； 渗漏突变株的应用； 抗结构类似物突变株的应用； 营养缺陷型回复突变株的应用； 增加前体物质的合成； 增加细胞渗透性，去除细胞内的终产物； 一些特殊调节机制的利用； 条件突变株的应用；选育不生成副产物的菌株。,代谢控制发酵工程能否获得成功，目的产物产量的高低，取决于微生物细胞自我调节控制是否能够解除或解除的程度。 能否解除微生

2、物的自我调节控制机制，而使代谢产物大量积累是代谢控制发酵育种的关键。,菌体及终端产物 初级代谢产物（如酶类） 次级代谢产物（如抗生素） 大分子合成素材性产物 外源基因产物,基因改造,基因导入,从易到难,1微生物终端产物:乳酸、酒精、CO2、乙酸、丙酮丁醇、酵母等。 2微生物生长自身必须的产物，如，糖化酶、蛋白酶、果胶酶等。 3微生物的次级代谢产物，如抗生素等 4素材性中间代谢产物，如，氨基酸、核苷酸、有机酸、核糖、乙酰辅酶A等，获得这些物质必须在遗传水平上打破微生物自身的代谢调节机制. 5微生物自身不能合成，自身也不需要的外源基因产物。,微生物代谢途径中获得的产物,菌种选育,代谢控制发酵,过程

3、控制,产品提纯,A,C,D,F,E,D,B,“五字方针”: 进、通、节、堵、出,相关的常用名词,营养(nurture)：生物体获得的或合成的营养素。 基本培养基（minimal medium）: 野生型菌株（原养型）可以生长而该菌株的一切营养缺陷型均不能生长的培养基。 完全培养基（Complete medium）: 所含有的营养成分足以供给原养型和营养缺陷型菌株的生长的培养基。常用于菌种的选育和微生物遗传学研究等。,加富培养基，enriched medium: 又称富集培养基。一般为在普通培养基中加入额外的营养物质的培养基。加入的额外营养物质诸如血、血清、动植物或微生物细胞的提取物等营养丰富物

4、质。常用于菌种筛选中，使所筛选的微生物在其中生长比其它微生物迅速而淘汰掉其他微生物。 结构类似物 与代谢途径中的代谢产物结构相类似，能与代谢物一样与调节酶结合引起酶活性的变化，但不具有代谢物生理功能的一类化合物。,营养缺陷突变株(Auxotroph),指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养基中补加该营养物质才能生长的突变型菌株。,渗漏型突变株 指遗传性障碍不完全的缺陷型。由于这种突变是它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏缺陷型能够少量地合成某一代谢最终产物，能在基本培养基上进行少量的生长 代谢互锁 Metabolic in

5、terlock 一种代谢产物的代谢调节，受来自另外一种从生物合成途径来看似乎完全无关的终产物的控制，这种现象叫代谢互锁,（一）、切（阻）断支路代谢,措施： 选育营养缺陷突变株 选育渗漏缺陷突变株,1、营养缺陷菌株的应用,合成途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累 实质上（遗传性的）解除了终产物的反馈抑制或反馈阻遏 中间产物或另一分支途径的末端产物得以积累 对某一产物的积累，起到节约碳源的作用 需要添加缺失的该物质才能在基本培养基上生长,5，-肌苷酸二钠（IMP) 5，-肌苷酸二钠又名肌苷酸钠，简称5-IMP，为白色结晶或结晶性粉末，含有约7.5分子结晶水。无臭，有特别强的鲜味。,营养缺陷型

6、应用举例 （一）,肌苷发酵是通过代谢流的堵塞来消除终产物的反馈调节，以达到中间产物的积累的。,枯草芽胞杆菌嘌呤核苷酸生物合成的调节机制,在枯草芽胞杆菌的嘌呤核苷酸生物合成中，有几个部位受到产物的反馈调节，催化这些步骤的酶都是变构酶。 PRPP合成5/-磷酸核糖胺途径中的酶受AMP、GMP的反馈抑制，并且二者在抑制该酶活性中有互相增效的作用。 IMP是AMP、GMP合成途径的分支点，分别接受AMP和GMP的反馈调节。即在AMP合成中，专一性酶腺苷琥珀酸合成酶（SAMP合成酶）仅受AMP系物质的反馈阻遏；在GMP合成中，专一性酶（IMP脱氢酶）仅受GMP系物质的反馈阻遏和反馈抑制。 枯草芽胞杆菌嘌

7、呤核苷酸生物合成的调节机制,肌苷酸发酵 腺嘌呤缺陷型（Ade-） 黄嘌呤缺陷型（Xan-） 鸟嘌呤缺陷型（Gua-）,5磷酸核糖焦磷酸 PRPP,谷氨酰胺,PRPP转移酶,5磷酸核糖胺,肌苷酸,腺嘌呤核苷琥珀酸 SAMP,黄嘌呤核苷酸XMP,腺嘌呤核苷酸 AMP,鸟嘌呤核苷酸GMP,肌苷（IR） 次黄嘌呤核苷,5-IMP,枯草芽孢杆菌,优先合成,当选用腺嘌呤缺陷型（Ade-）时，由于切断了IMP到AMP这条代谢支路，通过在培养基中限量控制腺嘌呤的含量，就可以解除腺嘌呤系化合物对PRPP转酰氨酶的反馈调节，因而可使肌苷酸得到积累。 在腺嘌呤缺陷型（Ade-）的基础上，若再诱变得到黄嘌呤缺陷型（X

8、an-）或鸟嘌呤缺陷型（Gua-），就可以切断IMP到GMP代谢支路，通过在培养基中限量控制黄嘌呤或鸟嘌呤的含量，就可以解除鸟嘌呤系化合物引起的反馈调节，从而增加肌苷酸的积累。,必需氨基酸： 赖氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、蛋氨酸（Met）、苏氨酸（Thr）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、缬氨酸（Val）。,营养缺陷型应用举例 （二）,赖氨酸为碱性必需氨基酸。由于谷物食品中的赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏而缺乏，故称为第一限制性氨基酸。,原理：在分支合成途径中，由于存在着多个终产物单独存在时都不能对其合成途径的关键酶实现全部的反馈抑制或阻遏的现象，故可以

9、利用这种机制选育营养缺陷型菌株，造成一个或两个终产物合成缺陷而使另外的终产物得以积累。,赖氨酸生产菌株有：谷氨酸棒杆菌；北京棒杆菌；黄色短杆菌等。 合成苏氨酸蛋氨酸的途径的关键酶天冬氨酸激酶是单一酶，受苏氨酸（Thr）和赖氨酸（Lys）协同反馈抑制。 苏氨酸和赖氨酸单独一种存在时不受抑制，仅当两者共存并都过量时才起抑制作用。,谷氨酸棒杆菌Lys合成途径,葡萄糖 天冬氨酸 AK 天冬氨酰磷酸 天冬氨酸半醛 PS HD 二氨基庚二酸(DAP) 高丝氨酸（Hom) HK 赖氨酸(Lys) 苏氨酸(Thr) 蛋氨酸(Met) 异亮氨酸,AK 天冬氨酸激酶； PS 二氢吡啶二羧酸合成酶 HD 高丝氨酸合

10、成酶； HK 高丝氨酸激酶,高丝氨酸缺陷型菌株 缺失HD酶,限量添加高丝氨酸,协同反馈抑制,赖氨酸生产菌株的调节机制 赖氨酸生产菌株合成赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸的途径的调节机制与大肠杆菌不同。E.coli的关键酶天冬氨酸激酶是同工酶。 而上述菌种的关键酶天冬氨酸激酶不是同工酶，是单一酶，该酶受苏氨酸（Thr）和赖氨酸（Lys）的协同反馈抑制，即天冬氨酸激酶在赖氨酸或苏氨酸单独存在时不受抑制，只有当两者共同存在且都过量时才起抑制作用。 利用高丝氨酸营养缺陷型（Hom-）或苏氨酸营养缺陷型（Thr-）菌株可以使赖氨酸得到积累,因此，在苏氨酸限量培养时，即使赖氨酸过剩，也能进行由天冬氨酸生成天冬氨酰磷

11、酸的反应。在苏氨酸缺陷型中，天冬氨酸半醛可以进一步转变为赖氨酸和高丝氨酸，高丝氨酸又进而转变为蛋氨酸，却不能生成苏氨酸。 在高丝氨酸营养缺陷型中，由于缺乏催化天冬氨酸-半醛成为高丝氨酸的高丝氨酸脱氢酶，因而菌株丧失了合成高丝氨酸的能力。这样，一方面切断料生物合成苏氨酸和蛋氨酸的支路代谢，使中间产物天冬氨酸半醛全部转入赖氨酸的合成；另一方面，通过限量添加高丝氨酸，可使蛋氨酸、苏氨酸限量产生，因而就解除了蛋氨酸、苏氨酸对天冬氨酸激酶的协同反馈抑制，使赖氨酸得以大量积累。,2、渗漏突变株的应用,特点： 1 解除了反馈调节； 2 在基本培养基上生长； 3 积累其他分支途径的终产物。 优点： 在发酵过程

12、中不需要添加营养缺失的物质。,渗漏缺陷型就是指遗传性障碍不完全的缺陷型。 由于这种突变是它的某一种酶的活性下降而不是完全丧失，因此，渗漏缺陷型能够少量地合成某一代谢最终产物，能在基本培养基上进行少量的生长。 调节模式 同营养缺陷型,（二）、选育抗结构类似物突变株,结构类似物的性质： 结构类似物的结构与代谢产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶相结合，使氨基酸、核苷酸、蛋白质等的合成途径关闭或启动，或抑制关键酶的活性； 结构类似物在生物学性质上不能代替代谢物。不能参与蛋白质、核酸等生物大分子的合成。 不具有代谢物生理功能的一类化合物。,抗结构类似物突变株也称为代谢拮抗性突变株，即诱发突变中产生的一些

13、对高浓度的代谢产物类似物不敏感的突变株，这些突变株既然能抗高浓度结构类似物的抑制和阻遏，也就能抗高浓度代谢终产物的反馈抑制和阻遏。 因为抗类似物突变株的代谢调节可以被遗传性地解除，故在发酵生产时可不再受培养基中成分的影响，生产较稳定。 抗类似物突变株不易发生回复突变，因此，在发酵生产上被广泛采用。,3抗结构类似物突变株的优点,正常的合成代谢的最终产物能与阻遏蛋白以及变构酶相结合，它对于有关的酶的合成具有阻遏作用，对于合成途径的第一个酶具有反馈抑制作用。它与酶的结合是可逆的。故当细胞中代谢终产物的浓度降低时，它就不再与阻遏物以及变构酶结合，这时有关的酶的合成以及它们的催化作用便又可继续进行。 由

14、于结构类似物与代谢最终产物结构相似，故它也能与阻遏物以及变构酶结合，但它们不能代替正常的氨基酸而合成蛋白质，即它们在细胞中的浓度没有降低，因此与阻遏物以及变构酶结合是不可逆的，是有关的酶不可逆地停止了合成，或是酶的催化作用不可逆地被抑制。,4结构类似物的作用机制,D/是D的结构类似物，一般情况下，D反馈抑制或阻遏AB的限速酶。当在培养基中加入D/时，D/与酶蛋白结合，抑制AB的反应。 抗结构类似物突变株就是对目的产物的结构类似物有抗性的菌株，以达到该菌株不受终产物D反馈抑制或阻遏的效果，使D大量积累。,5.一个菌株如何成为抗类似物突变株的？,一个具有正常代谢的微生物，其代谢产物的结构类似物不可

15、逆的抑制了或阻遏了合成该代谢产物的合成酶类，使菌体不能正长，直至死亡。 抗结构类似物突变株，其代谢失常，结构类似物不能与关键酶或阻遏蛋白结合而改变酶的活性。可以使合成途径不能受到终产物的抑制，因此，终产物可以积累，该菌体处于非健康生长状态。 这种突变株对高浓度终产物的反馈抑制不敏感是因为编码酶蛋白的结构基因突变，使限速酶蛋白质的性质发生了变化；对阻遏不敏感则是因为调节基因或操纵基因突变，使阻遏蛋白与操纵基因的亲和力发生了变化。,在抗代谢物的上方注一“r”，如抗D-Arg的突变株以D-Argr表示，即L-精氨酸抗株。,6抗结构类似物突变株的表示方法,7Xr突变株的选育方法,抗性突变株的最常用的选

16、育方法是梯度平板法，即将一定浓度的代谢类似物加入到培养基中，制成浓度梯度平板，将诱变的菌液涂布到平板上，经过培养可出现三种情况： （1）结构类似物浓度太低，不能抑制菌株生长； （2）结构类似物浓度太高，全部抑制，菌株不能生长； （3）结构类似物浓度适中，有少数耐结构类似物的突变株生长，可再经进一步分离纯化及经济性状鉴定，既可作为生产菌种。,Xr突变株的选育示意图,S（氨基乙酸）-L-半胱氨酸； AEC-Lys； AHV-Thr； MetHxr-Met； 几乎所有的氨基酸和核苷都可以通过采用抗结构类似物突变株的方法进行发酵生产。 对于生物合成途径已弄清的目的产物，当不能从野生型、营养缺陷型得到生

17、产菌株时，抗结构类似物突变株是一条重要的选择途径。,8常用的结构类似物,9抗结构类似物突变株应用举例,精氨酸（Arg）发酵是利用抗结构类似物突变株进行的。 从谷氨酸合成精氨酸一共经过8个酶促反应，当有精氨酸存在时，这些酶的合成都处于被阻遏状态，此外，精氨酸的生物合成还要受到精氨酸本身的反馈抑制。,谷氨酸棒杆菌,Coynebacterum glutamicum,谷氨酸,N-乙酰谷氨酸,N-乙酰-谷氨酰磷酸,N-乙酰-谷氨酸-半醛,N-乙酰鸟氨酸,鸟氨酸,瓜氨酸,精氨琥珀酸,精氨酸,D-精氨酸抗性突变株,精氨酸氧污酸盐抗性突变株,精氨酸的生物合成途径图,由于精氨酸的生物合成途径是单功能合成途径，精

18、氨酸的合成受到其本身的反馈抑制和阻遏，不像分支途径可以切断支路代谢，故主要采用抗精氨酸类似物突变株，如D-精氨酸抗性、精氨酸氧肟酸盐抗性突变株，以解除精氨酸自身的反馈调节，使精氨酸得以积累。,（三）、营养缺陷型回复突变株的应用,并非所有的代谢产物都能找到结构类似物，或多重交叉难以增加抗性标记，或反馈调节很复杂时，可用营养缺陷型回复突变株的方法来选育高产菌株,1营养缺陷型回复突变原理,当一个菌株由于突变而失去某一遗传性状后，经过回复突变可以再回复其原有的遗传性状。但这个回复并非原有酶的回复，往往只有催化活性而无调节位点。 因为当某一结构基因发生突变后，该结构基因所编码的酶就因结构的改变而失活，而

19、经过第二次突变（回复突变）后，该酶的活性中心结构可以复原，而调节部位的结构常常并没有恢复，结果是一方面酶恢复了活性，而另一方面反馈抑制却已解除或被变得较弱，故可以利用营养缺陷型的回复突变性来提高发酵产品的产量。,2 回复突变株的应用举例,绿链霉菌（Streptomyces viridifaciens）生产金霉素，在金霉素的合成过程中，由蛋氨酸供应甲基，蛋氨酸在细胞中的浓度高可以促进金霉素的合成。 一种方法：将绿链霉菌变成Met-，然后恢复Met,这样就解除了蛋氨酸合成的反馈抑制，提高了细胞中蛋氨酸的含量，结果有85%的回复突变株的金霉素产量提高了1.2-3.2倍。 另一条途径：Demain先将

20、绿链霉菌诱变成不产金霉素的突变株，然后再进行回复突变，结果是金霉素的产量提高了6倍。,3营养缺陷型回复突变的选育示意图,(四）、增加前体物质的合成,通过选育某些营养缺陷型或结构类似物抗性突变株以及克隆某些关键酶的方法，增加目的产物的前体物的合成，有利于目的产物的大量积累。体现“通”。,（1）增加前体物质的合成方法,1 在分支代谢途径中 （1）在分支代谢途径中，切断除目的产物外的其它控制酶的终产物的分支合成途径，增加目的产物的前体积累，可以使目的产物的产量增加。,2 设法提高生物合成途径中分支点的代谢流强度，使分支点处的中间产物增多，导致目的产物的积累增加。,3举例：在以乳糖发酵短杆菌为出发菌株

21、，选育Lys发酵菌株时，乳糖发酵短杆菌的抗AEC突变株，可以产赖氨酸达到30g/L左右，再育成具有丙氨酸营养缺陷型AJ3799（AECrAla）的突变株，产赖氨酸提高到39%g/L。,Glucose(C6) 组氨酸（His,C6N3) 戊糖（C5) 甘氨酸(Gly,C2N) 四碳糖 苯丙氨酸(Phe,C9N) 三糖 （C3） 丝氨酸（Ser,C3N) 酪氨酸 (Tyr,C9N) 莽草酸 色氨酸(Trp C11N2) 半胱氨酸（Cys,C3NS) 丙氨酸 (Ala,C3N) 丙酮酸（Pyr,C3 ) C5 缬 氨酸（Aal,C5N) 赖氨酸(Lys,C6N2) 二氨基庚二酸(DAP, C7N2）

22、 Acetyl(C2) 亮氨酸（Leu, C6N) 蛋氨酸（Met,C5NS) 天冬氨酸（Asp，C4N) 草酰乙酸（Oxalacetae ,C4) 柠檬酸（Citrae, C6) 苏氨酸（Thr ,C4N) 脯氨酸（Pro,C6N4) 异亮氨酸（Ileu,C6N） a-酮戊二酸（C5) 谷氨酸（Glu C5) 精氨酸（Arg,C6N4),以葡萄糖为碳源氨基酸代谢途径简图,（2）解除前体物的反馈抑制,当目的产物的生物合成是从其它途径的终产物开始时，除设法解除目的产物自身合成的反馈调节外，还应设法解除对其前体物合成的调节，如图。 两条不同的代谢途径，E是目的产物，C是途径一的终产物，又是途径二的

23、前体物。应解除E自身的反馈调节，还要解除C合成的反馈调节。,解除前体物的反馈抑制举例,异亮氨酸（Ile）发酵菌株的选育，苏氨酸是异亮氨酸的前体物。为了积累异亮氨酸，除了解除对异亮氨酸生物合成的反馈调节外，还应解除对其前提物苏氨酸生物合成的反馈控制，增加苏氨酸的生物合成，从而提高异亮氨酸的积累量。,葡萄糖 AK 天冬氨酸 天冬氨酰磷酸 天冬氨酸半醛 PS HD 二氨基庚二酸(DAP) 高丝氨酸（Hom) HK 赖氨酸(Lys) 苏氨酸(Thr) 蛋氨酸(Met) 异亮氨酸 AK 天冬氨酸激酶；PS 二氢吡啶二羧酸合成酶；HD 高丝氨酸合成酶；HK 高丝氨酸激酶 Thr -氨基-羟基戊酸(AHV)

24、 AHVr,解除苏氨酸的反馈抑制,充分利用乙醛酸补充途径,乙醛酸循环对植物和某些微生物特别重要： 第一，借助此附属路线可以利用脂肪酸或乙酸作为唯一碳源而获得生物能量。 第二，可以利用脂肪酸或乙酸作为唯一碳源合成糖类化合物和氨基酸，蛋白质维持生长代谢。没有乙醛酸循环，则脂肪酸分解生成乙酰COA，进入TCA循环而完全氧化，不能合成糖类。,乙酸合成谷氨酸,葡萄糖,顺乌头酸,磷酸烯醇式丙酮酸,柠檬酸,丙酮酸,乙酰辅酶,琥珀酸,乙酸,L谷氨酸,异柠檬酸,酮戊二酸,CO,苹果酸,反丁烯二酸,草酰乙酸,乙酰磷酸,乙酰辅酶A,乙醛酸,CO,柠檬酸发酵,葡萄糖,顺乌头酸,磷酸烯醇式丙酮酸,柠檬酸,丙酮酸,乙酰辅

25、酶,琥珀酸,异柠檬酸,酮戊二酸,CO,苹果酸,反丁烯二酸,草酰乙酸,乙酰辅酶A,乙醛酸,CO,CO2,（4）利用基因工程技术克隆（clone）加强主代谢流的酶类,参考途径工程 张惠展主编,（五）增加细胞透性,去除细胞内的终产物,改变细胞膜渗透性,将属反馈控制因子的终产物迅速、不断地排出细胞外,不使终产物积累到引起反馈调节的浓度,就可以解除反馈控制。,谷氨酸发酵增加细胞透性的主要措施,生物素对细胞膜合成的影响 青霉素对细胞壁合成的影响 表面活性剂对细胞通透性的影响,生物素的生理意义,乙酰辅酶A（C）羧化酶的辅酶，参与脂肪酸的生物合成，脂肪酸是形成细胞膜磷脂的主要成分，从而间接地起到干扰细胞膜磷脂

26、合成的作用。,影响细胞膜透性的其他措施,丧失脂肪酸合成油酸缺陷型 丧失 磷酸甘油脱氢酶的甘油缺陷型,青霉素对细菌细胞壁合成的影响,青霉素属内酰胺类抗生素，主要抑制粘肽的合成，阻止粘肽链的交叉连接，使细菌无法形成坚韧的细胞壁。,表面活性剂对细胞透性的影响,表面活性剂破坏细胞膜的脂质双分子层结构，选择透性失控。,黄色短杆菌谷氨酸发酵,PEP PC 草酰乙酸 TA Citrate Asp 酮戊二酸 GD Glu Glu优先比天冬氨酸合成，Glu过量时，就会反馈控制谷氨酸脱氢酶 （GD），使草酰乙酸转向合成Asp，当Asp过量时，Asp反馈抑制 PC。正常代谢中，发酵液中Glu不积累。PC磷酸烯醇式丙

27、酮酸羧 化酶，GD谷氨酸脱氢酶,增加透性的措施,1 生物素亚适量 2 添加青霉素 3 吐温80 改变细胞膜的透性，使优先合成的Glu很快渗漏到细胞外，解除了反馈调节，发酵得到Glu。,（六）一些特殊调节机制的利用,1 多种代谢产物反馈控制的利用,在多种产物控制机制中,只有当与反馈控制的有关的全部终产物，同时过剩的情况下,才能完全的或最大程度的反馈控制。任何一种终产物单独过剩时，不产生或部分产生的反馈控制作用。,天冬氨酸 天冬氨酰磷酸 天冬氨酸半醛 二氨基庚二酸 高丝氨酸 苏氨酸 蛋氨酸,黄色短杆菌发酵生产赖氨酸,赖氨酸,控制：苏氨酸不过量,黄色短杆菌赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸生物合成调节机制见上图

28、 在赖氨酸发酵育种中，可选育丧失高丝氨酸脱氢酶（HD）的高丝氨酸缺陷型或丧失高丝氨酸激酶（HK）的苏氨酸缺陷型，通过限量添加苏氨酸，解除对公用酶天冬氨酸激酶（AK）的协同反馈抑制，使赖氨酸积累。,在一个分支途径上的两个终产物,始终保持一个平衡比例。 a D E 例：A B C F G 该途径优先合成E，E过量后就会抑制a 酶的活性，使C转向合成G；G过剩后，G能解除E对a酶的抑制，C重新合成E。,2 平衡合成的利用,黄色短杆菌中Asp与Acetyl CoA的平衡合成： Glucose PEP Pyr Oxaloacetate Acetyl CoA Asp citrate,如果积累 Asp ，优

29、先积累Acetyl CoA,在黄色短杆菌中，天冬氨酸的生物合成与另一分支的分解途径的中间产物乙酰辅酶A的形成，形成平衡合成。因而，在丧失乙酰CoA代谢的主要酶柠檬酸合成酶的突变株或其回复突变株中，积累于细胞内的乙酰CoA能解除天冬氨酸对其自身生物合成的控制，使天冬氨酸积累提高。,一种代谢产物的代谢调节，受来自另外一种从生物合成途径来看似乎完全无关的终产物的控制，这种现象叫代谢互锁。 代谢互锁只是在终产物浓度较高时才发生，而且这种抑制（阻遏）作用是部分性的，不完全的。 代谢互锁的调节模式 A B C D E 代谢互锁不仅有抑制与阻遏作用，而且也发现有激活作用。,3.代谢互锁的利用metaboli

30、c interlock,例：脯氨酸的发酵合成途径： 谷氨酸 谷氨酸半醛 二氢吡咯二羧酸 脯氨酸（Pro） 在脯氨酸的发酵中，利用黄色短杆菌的异亮氨酸缺陷型，即丧失苏氨酸脱氢酶的突变株，在限量供给异亮氨酸的条件下，可以积累脯氨酸。 因为在异亮氨酸缺陷型菌株中，苏氨酸合成量增大，苏氨酸与赖氨酸协同反馈抑制天冬氨酸激酶，致使天冬氨酸增多，ATP过剩；又由于添加过量生物素，谷氨酸不宜渗透，故而被高浓度地保留在细胞中，结果促进了谷氨酸激酶所催化的反应，导致易于通过细胞膜的脯氨酸的积累。,c a D E A B C b F G,4.优先合成的变换 preference synthesis,由于a酶的活性远

31、大于b酶的活性，代谢过程优先合成E。E达到一定浓度时，就会抑制a酶，使代谢转向合成G。G的浓度过量时，就会对c酶产生抑制。 在分支合成途径的调节中，因为在分支点处的优先合成与反馈抑制一起完成重要的功能，所以，优先合成的变换会引起一种终产物的过剩。 例：天冬氨酸族氨基酸合成,（七）条件突变株的应用,环境条件对微生物的代谢有显著的影响。 条件突变的原因：蛋白质的结构基因发生突变。 条件突变:某菌株或病毒经基因突变后,在某种条件下可正常的生长、繁殖，并实现其表型；而在另一条件下，却无法正常的生长、繁殖的突变类型。 温度敏感突变株；抑制性突变；链霉素依赖性突变和低温敏感性突变等。,温度敏感突变株：相当

32、于高温下的营养缺陷型。 （1）温度敏感突变株的概念：通过诱变可以得到在低温下生长、而在高温下却不能生长的突变株，叫温度敏感突变株。 （2）微生物适应生长的温度范围较宽，很多微生物在2050温度范围内都能生长。对温度敏感的原因多是因为突变，使具有某种功能的酶蛋白质中的一部分氨基酸排列发生变化，导致酶的性质变化，使其转变得容易受热而失去活性。,（3） 温度敏感突变株的选育措施：为了便于检出温度敏感突变株，在诱变前，应选择温度范围宽的菌株作为出发菌株，以保证必要的温度差。 （4）温度敏感突变株的特点：温度敏感突变株在高温下不能生长，是由于该酶受热失活之故，如果慢慢地改变培养温度，就会发现酶活性将在0

33、100%之间变化，但是因为酶蛋白组成中改变了一种氨基酸，多数情况下不能恢复到100%的野生型活性。 若该酶是蛋白质、维生素或核苷酸生物合成途径上的某种酶，则该突变株在高温下就是一种营养缺陷型。,（5）温度敏感突变株举例 在谷氨酸生产中，使用温度敏感突变株TS-88，通过控制发酵温度，在生长阶段将发酵温度由30提高到40，可提高糖的利用率和谷氨酸的产量。因此，使用温度敏感突变株在发酵期间仅需控制温度，而不需添加表面活性剂或抗生素，就能在富含生物素的天然培养基中提高谷氨酸的产量。,（八）选育不生成副产物的菌株,1 切断代谢支路，附加营养缺陷型标记； 2 切断目的产物的分解途径； 3 选择不利于副产

34、物生成的条件,九、组成型突变株的应用,组成酶(constitutive enzyme)：在特定的细胞内，无论其组织或介质的组成如何、诱导物是否存在，它都有一种接近恒定数量的酶存在或本能的合成的酶，为组成酶。 如参与细胞基本新陈代谢和生长繁殖的各种酶。,组成型突变菌株(constitutive mutant)：酶的产生从需要诱导（野生型）变成不需要诱导的一类突变株。 用于过量表达淀粉酶、葡萄糖淀粉酶（糖化酶）、脂肪酶或蛋白酶，这种突变型不依赖培养条件或诱导化合物的存在。,原理：由于菌株的调节基因发生突变，产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合；或者操纵基因突变不能被阻遏物所识别，结果使阻遏物不再与

35、它结合。 这两类突变均称为组成突变，突变导致操纵子结构基因所编码的与代谢作用直接相关的酶，不受控制地转录（即此时即使没有诱导物，聚合酶也能转录），酶的生成将不需诱导物，或不再受末端产物或分解代谢物阻遏，即可大量生产，故此酶就像细胞的一个组分，经常存在着。,第三节 微生物代谢控制发酵的措施,要使微生物大量积累发酵产品，就要控制微生物对自身代谢的调节作用。 微生物发酵生产中的代谢控制，主要有以下两条途径：控制培养条件和控制遗传型。 内因是变化的根据，所以改变微生物的遗传型往往是控制代谢的更为有效的途径；而培养条件的优化对微生物的发酵也有重要的影响。,（一）培养条件的控制,1加诱导物（包括安慰、间接

36、诱导物），以诱导代谢途径中关键酶的合成。 2利用混合碳源、单一碳源限量流加和以利用率较低的衍生物作为碳源，以解除分解代谢产物的阻遏或抑制。,3限制特种成分，即控制缺陷型所需物质的量，如IMP发酵（Ade-）限量腺嘌呤，赖氨酸发酵（Hom-）限量高丝氨酸等；限制一般成分，如蛋白酶生产中限制氨基酸的量。 4微生物种子培养中采用高营养或添加某种药剂，以防止发酵过程中回复突变株的产生与增值。,5生产菌种保藏和种子扩大培养时，要严防变异，尤其是抗性和缺陷型遗传标记的恢复突变； 要提高对菌种变异的认识，经常检查遗传标记，合理保存菌种，减少传代次数，利用经过选择的培养基，排除产物合成的抑制，培养基中加入抗性

37、的代谢拮抗物和充足的要求性物质，定期纯化分离，选出遗传标记明显的菌落保存和扩大培养。,6添加在被阻抑阶段后面的前体，以绕过阻抑，如: 添加-溴丁酸或-氨基丁酸等，生产异亮氨酸，添加氨茴酸，绕过反馈抑制，生产色氨酸等； 添加酶抑制剂，如产氨短杆菌KY7309培养24h后，添加狭霉素C，抑制CMP合成酶，积累5-XMP。 7控制发酵培养基的C：N、磷酸盐、pH、NH4+、溶氧水平、缺陷营养成分等，防止发生发酵转换现象，加强自控管理。,8增加细胞膜的渗透性，使细胞中的代谢终产物外渗。 如糖质发酵谷氨酸中，控制生物素亚适量；生物素过剩，添加吐温80或其它表面活性剂、饱和脂肪酸、青霉素等； 甘油缺陷型限

38、量添加甘油； IMP生产中限量添加Mn2+含量。,（二）遗传型的控制,1选育组成型菌株：解除酶的诱导，使酶在没有诱导物时就可以产生。 组成型突变菌株(constitutive mutant)：酶的产生从需要诱导（野生型）变成不需要诱导的一类突变株。,原理：由于菌株的调节基因发生突变，产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合；或者操纵基因突变不能被阻遏物所识别，结果使阻遏物不再与它结合。这两类突变均称为组成突变，突变导致操纵子结构基因所编码的与代谢作用直接相关的酶，不受控制地转录，酶的生成将不需诱导物，或不再受末端产物或分解代谢物阻遏，即可大量生产，故此酶就像细胞的一个组分，经常存在着。,2选育抗分解阻遏或抗分解抑制的突变型：解除分解代谢物的阻遏或抑制。可以利用特殊氮源，利用鉴别性培养基，选取链霉素依赖型和交替培养等方法选得。 3选育某些特定的营养缺陷型：如谷氨酸生产菌（生物素-）；赖氨酸生产菌（Hom-）；肌苷酸生产菌（Ade- +Xan-）等。,4选育渗漏缺陷型： 即不完全遗传障碍营养缺陷型，能自己合成微量的某一代谢终产物，以避免反馈调节。筛选的方法是在基本培养基上选取长得特别慢和特别小的回复突变菌落，这样往往可得渗漏突变型菌株。,