DB12T 409-2009 蛋与蛋制品中抗生素残留检验方法微生物法

DB12/T409-2009蛋与蛋制品中抗生素残留检验方法微生物法Examinationofresidueofantibio天津市质量技术监督局发布I本标准的附录A、附录B为规范性附录。本标准由天津市产品质量监督检测技术研究院、太阳食品(天津)有限公司提出。本标准由天津市产品质量监督检测技术研究院负责解释。本标准由天津市质量技术监督局批准。本标准起草单位：天津市产品质量监督检测技术研究院、太阳食品(天津)有限公司。本标准主要起草人：张洁、汪晓冬、高亦军、陈相富、赵用花、刘顺荣。本标准首次发布。心1蛋与蛋制品中抗生素残留检验方法微生物法本标准规定了蛋与蛋制品中抗生素残留检验的制样及微生物抑制检验方法。本标准适用于蛋(蛋黄部分)与蛋制品(蛋黄制品)中抗生素残留筛选检验。本标准不适用于蛋(蛋黄部分)与蛋制品(蛋黄制品)中抗生素残留量的定量测定。修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。本方法根据抗生素对敏感菌的抑制作用，通过抑菌圈来判定是否含有抗生素。4.6游标卡尺：测量范围0mm~200mm,精度0.02mm,或抑菌圈测量仪。4.7平皿：直径(86±1)mm,底部平整光滑，经灭菌。4.11分析天平：感量0.1mg。4.12冰箱：0℃~8℃。4.13pH计：感量0.1。5.1.1藤黄微球菌MicrococcusluteusATCC9341,菌种的保存见附录A。5.1.2枯草芽胞杆菌BacillussubtilisATCC6633,菌种的保存见附录A。5.1.3蜡样芽胞杆菌蕈状变种BacilluscereusVar.mycoidesATCC11778,菌种的保存见附录A。25.2.3检测用培养基：抗生素培养基5号(AM5)、抗生素培养基8号(AM8)(配方见附录B)。a)0.2mol/L柠檬酸溶液：称取柠檬酸(C₆H₈O₇)4.2g溶解在100mL蒸馏水中；b)0.5mol/L氢氧化钾溶液：称取氢氧化钾(KOH)2.8g溶解在100mL蒸馏水中；c)混合液：0.2mol/L柠檬酸溶液和0.5mol/L氢氧化钾溶液等量混合；d)柠檬酸一丙酮缓冲液体积比：混合液+丙酮+蒸馏水=35.3.1.2pH4.5磷酸缓冲液：称取13.60g磷酸二氢钾(KH₂PO.)溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。5.3.1.3pH6.0磷酸缓冲液：称取8.00g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)及2.00g磷酸氢二钾(K₂HPO₄)溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。5.3.1.4pH8.0磷酸缓冲液：称取0.52g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)及16.73g磷酸氢二钾(K₂HPO₄)溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。5.3.2.1氨苄西林标准储备液：称取氨苄西林标准品10mg,用灭菌去离子水溶解并定容至1000Hg/mL,置2℃~8℃冰箱中保存，可使用2d。5.3.2.2氨苄西林标准工作液：吸取250HL氨苄西林标准储备液，用pH6.0磷酸缓冲液稀5.3.2.3卡那霉素标准储备液：称取卡那霉素标准品10mg,用灭菌去离子水溶解并定容至1000μg/mL,置2℃~8℃冰箱中保存，可使用30d。5.3.2.4卡那霉素标准工作液：吸取400HL卡那霉素标5.3.2.5土霉素标准储备液：称取土霉素标准品10mg,用0.1mol/mLHCl溶解并定容置2℃~8℃冰箱中保存，可使用7d。5.3.2.7红霉素标准储备液：称取红霉素标准品10mg,用少量甲醇溶解，再用灭菌去离子水溶解并定容至1000μg/mL,置2℃~8℃冰箱中保存，可使用30d。5.3.2.8红霉素标准工作液：吸取250HL的红霉素6.1.1将鲜蛋去壳，去掉蛋清，将蛋黄在滤纸上滚动、擦拭，尽可能去掉残留蛋清，取蛋黄，搅匀，备用。6.2称取15.0g混匀的试样于100mL三角瓶中，加入柠檬酸--丙酮缓冲液60mL,充分振荡混匀，过滤，滤液备用。滤液应确保其pH值在6.5～7.5之间。37.1.1藤黄微球菌ATCC9341菌悬液：将复苏的菌种接种于盛有普通营养琼脂的克氏瓶中，30℃±1℃培养18h~24h后，用灭菌生理盐水完全洗下菌苔，制成菌悬液。置2℃~8℃冰箱中可保存15d。营养琼脂的克氏瓶中，30℃±1℃培养7d,镜检芽胞数达到80%以上(如果达不到，可再培养数日，如培养10d以上，芽胞数仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用。)|,用灭菌生理盐水完全洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，65℃±1℃水浴加热30min,经3000r/min离心20min,弃去上清液，如此重复洗涤芽胞两次，然后用适量灭菌生理盐水制成菌悬液。置2℃~8℃冰箱中可保存30d。把不同浓度藤黄微球菌ATCC9341菌悬液加入AM5培养基中，30℃±1℃培养18h后，使0.025Hg/mL氨苄西林标准工作液可产生(14±1)mm清晰、完整的抑菌圈，而获得最适宜菌悬液用量。将经过确认的适宜浓度的菌悬液无菌吸取1mL加到溶化后冷却至50℃左右的灭菌AM5培养基8mL中，充分混匀，保持水平使其凝固。制备好的平板置2℃~8℃冰箱中可保存2d～3d.那霉素标准工作液可产生(14±1)mm清晰、完整的抑菌圈，而获得最适宜菌悬液用量。将经过确认的适宜浓度的菌悬液无菌吸取1mL加到溶化后冷却至50℃左右的灭菌AM⁵培养基8mL中，充分混匀，保持水平使其凝固。制备好的平板置2℃~8℃冰箱中可保存2d～3d。土霉素标准工作液可产生(14±1)mm清晰、完整的抑菌圈，而获得最适宜菌悬液用量。将经过确认的标准工作液，以柠檬酸-丙酮缓冲液作空白对照，待滤纸干后，把滤纸片以适当间隔置于平板上，每个平板最多不超过6片，用无菌镊子轻压使其固定，冷藏放置30min,再以30℃±1℃培养，18h后观察如样液在三种平板上均无抑菌圈，标准工作液的抑菌圈达到(14±1)mm,即报告“阴性”;如样液在三种平板中任一平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径小于12mm,大于10mm;柠檬酸-丙酮缓a)β-内酰胺类(氨苄西林):0.025mg/kg;4b)氨基糖苷类(卡那霉素):0.2mg/kg;c)四环素类(土霉素):0.05mg/kg;d)大环内酯类(红霉素):0.05mg/kg。5(规范性附录)普通营养琼脂培养基中，经30℃±1℃培养18h~24h后，用灭菌脱脂棉塞密封冷藏保存。每隔30d至45d传代一次。普通营养琼脂培养基中，经30℃±1℃培养18h~24h后，分别接种于含有10%~20%脱脂乳的普通营养肉汤中，用灭菌脱脂棉塞密封后冷冻保存。需-70℃保存时，接种于含有10%～16%甘油的普通营养肉汤中；需-20℃保存时，接种于含有40%甘油的普通营养肉汤中。可保存90d。在制备菌悬液前，先将保存的标准菌种接种于普通营养肉汤中，30℃±1℃培养18h~24h后使用。(规范性附录)c)蛋