DB12T 200-2004 鲜番茄及番茄制品中转基因成分的定性检测方法

备案号：鲜番茄及番茄制品中转基因成分的定性检测方法infreshtomatoandtomatoprocessedproducts天津市质量技术监督局发布IDMIF-GEN-TIBI、DMIF-GEN-T1B2、DMIF-GEN-T1B3、DMIF-GE本标准由天津市农产品质量监督检验测试中心提出。本标准起草单位：天津市农产品质量监督检验测试中心、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：金红、赵昕、王永、程奕、郑贵忠。1鲜番茄及番茄制品中转基因成分的定性检测方法本标准规定了鲜番茄和番茄制品中转基因成分的定性聚合酶链式反应(简称为PCR)检测方法。本标准适用于对新鲜番茄果实和以番茄果实加工而成的番茄酱、番茄沙司和番茄汁等制品中转基因成分的定性PCR检测。适用于转基因番茄Nema282F品系的鉴定。2规范性引用文件修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1193基因检验实验室技术要求SN/T1194植物及其产品转基因成分检测的抽样和制样方法SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法下列术语、定义和缩略语适用于本标准。物种本身不具有的、而是来源于其他物种的功模板基因序列先经高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTPs)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。对样品中转基因成分进行检测，以判定该样品是否为转基因产品。3.4.1GMO:geneticallymodifi3.4.2PCR:polymerasechainreaction,聚合酶链式反应。3.4.3DNA:deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸。3.4.4dNTPs:deoxyribonucleosidetriphosphate,脱氧核甘三磷酸。3.4.5CaMV35S:35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus,花椰菜花叶病毒35S启动子。3.4.8PG:polygalacturonase,多聚半乳糖醛酸酶3.4.9Nema282F:美国Zeneca公司的获准商品化启动子、NOS终止子和neo基因及人工合成反义PG基因等。24防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。5抽样和制样按照SN/T1194中规定的方法进行。6.1原理番茄原料所插入的外源基因设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)技术，特异性扩增外源基因的DNA片断，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有转基因成分。6.2主要仪器6.2.1电子天平(感量分别为0.01g和0.0001g)。6.2.2恒温水浴装置。6.2.3低温超速离心机，台式冷冻离心机。6.2.8高温干燥箱。6.2.9微量移液器(0.1~2.5HL,1~10HL,10~100HL,100~1000HL)。6.2.12凝胶成像分析系统或紫外透射分析仪。6.2.17紫外分光光度计6.3试剂和材料实验用水为I级。6.3.2三羟甲基氨基甲烷(Tris)。6.3.3二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H₂O)。6.3.4聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。6.3.8三氯甲烷：异戊醇=24:1(体积比)。6.3.970%乙醇。g,PVP20g,用浓盐酸调pH值至8.0。36.3.12氯化钠溶液(1.2mol/L):1000ml水中溶解70g。6.3.13乙酸钠溶液(3mol/L):800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2,加水定容至1L。6.3.14Tris-HCI溶液(0.1mo/L,pH8.0):800ml水中溶解12.114gTris,冷却至室温，用浓盐酸调pH值至8.0,定容至1L。6.3.15TE缓冲液：Tris0.010mol/L,Na₂EDTA1.0mmol/L,用盐酸调节pH至8.0。6.3.18dNTP(dATP,dCTP,dGTP,dUTP)溶液6.3.19Taq酶：2U/HL。6.3.20实验用水：按GB/T6682规定执行。6.3.21溴化乙锭(EB):10m6.3.26Nema282F转基因番茄阳性样品。6.3.28滤芯吸头(10L,20HL,100L,200HL,1000HL)。6.3.29PCR反应管(200H)。6.3.31引物：转基因番茄的内源基因和外源基因检测时所用的引物序列见表1。检测基因扩增片断长度基因性质内源基因外源基因aatcctgttgccggtcttg-3'’tatcctagttgcgcgcta-3’外源基因gatccttagaagcatctagt-3’人工合成基因品系鉴定外源基因外源基因*:转基因番茄时扩增出383bp和180bp两个不同大小的DNA片段，非转基因番茄只能扩增出383bp6.4.1样品的DNA提取取番茄酱等液态加工样品50mL,室温10000r/min离心15min,弃上清，取沉淀3g转入预冷的4研钵中，置于冰上研细，全部转入50mL离心管中。用0.1molLTris-HCI(6.3.14)溶液反复洗涤样品三次，方法为加入30mL0.1mol/LTris-HCl溶液(6.3.14),反复摇匀，于4℃10000r/min离心15min,弃上清，留沉淀用于DNA提取。取鲜番茄样品2g,置预冷研钵中，加入液氮(6.3.30)研磨成粉末状，转入2mL离心管中，用取经预处理的样品加入10mL经65℃预热的CTAB提取缓冲液(6.3.10),混匀。65℃水浴1小时，期间每隔10min轻轻颠倒混匀一次加入等体积的丰氯甲烷+异戊醇(6.3.8)缓慢颠倒摇匀5min,于10000r/min离心10min,取上清，摇匀，室温静置1小时，12000r/min离心10min,弃上清，沉淀加入1.2mol/LNaCl溶液(6.3.12)1mL溶解沉淀，室温静置5min,加入等体积三氯甲烷+异戊醇(6.3.8)颠倒摇匀1min,于12000r/min离心10min,取上清，加入10%的3mol/L乙酸钠(6.3.13)和等体积的冷异丙醇(6.3.7),缓慢混匀，4℃静置过夜，14000r/min离心15min,弃上清，加入400HL70%冷乙醇(6.3.9)洗涤沉淀，除去残留的乙醇，待沉淀干燥后，加入30HL灭菌的去离子水(6.3.20)溶解从番茄加工制品提取的DNA沉淀，加入100HLTE(6.3.15)溶解从鲜番茄提取的DNA沉淀，均置-20℃保存备用。6.4.2样品中DNA产量和质量的鉴定采用紫外分光光度法对从鲜番茄中提取的DNA进行产量和质量的鉴定。紫外分光光度法检测核酸的最佳范围是2wg/mL~50Hg/mL,OD值应该在0.05~1的区间内。将DNA溶液做适当的稀释，放入紫外分光光度计的比色皿中，于260nm处测定其链DNA。PCR级DNA溶液的OD2采用内源基因扩增法鉴定从番茄加工制品中提取的DNA的质量。通过PCR技术，扩增番茄内源6.4.3定性PCR检测6.4.3.1PCR反应体系检测鲜番茄和以番茄果实为原料的番茄加工制品中内源基因和外源基因采用的PCR检测体系见表2。反应体系中各试剂的量根据反应体系的总体积进行适当调整。每个反应称10×PCR反应缓dNTP溶液(正向引物(1反向引物(D水对进行PCR检测时反应体系必须设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：用Nema282F转基因番茄材料中提取的DNA作为PCR反应体系的DNA模板；阴性对照：用非转基因番茄材料中提取6.4.3.3样品中内源基因和外源基因的检测5检测鲜番茄和以番茄果实为原料的番茄加工制品中的内源基因和外源基因的PCR检测的参考反应条件见表3。反应条件需根据检测仪器的性能做相应调整。被扩增的扩增最后延伸SSNptI(215b缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶(凝胶融化后晾至60℃合适的DNA分子量标记物，选择合适的电压(3V/cm~5V/cm)6.4.3.5凝胶成像分析(照相)电泳结束后，将球脂糖凝胶置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。6.4.4结果分析与判定对于番茄特异性内源基因PG34片段的检测，如果阴性对照、待测样品和阳性对照的PCR产物都出现383bp的条带，则表明提取的待测样品DNA符合PCR反应的要求，能用于外源基因的检测；否则不能用于检测外源基因，应该重新提取待测样品DNA,直到能扩增出383bp的条带，防止检测中产对待测样品DNA提取液进