重组DNA技术的基本工具课件高二下学期生物人教版选择性必修34

第3章

基因工程

我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。(P67)棉花棉铃虫幼虫

✮1998年中棉所成功培育出我国第一个国审抗虫杂交棉新品种------中棉所29，使低龄棉铃虫的死亡率超过90%；

✭2002年成功培育出我国第一个双价转基因抗虫棉新品种------中棉所41，该品种能够缓解棉铃虫抗药性。

为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以？

是按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。生物体外1.操作环境：2.操作对象：3.操作水平：第3章

基因工程1.概念：P674.原理：5.结果：基因DNA分子水平基因重组按照人们的需要定向改造生物的遗传特性1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1958年，梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。几乎同一时期确立的中心法则阐明了遗传信息流动的方向。1961年，尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。1970年，科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）1950年，爱德曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。2年后，桑格首次完成了对胰岛素氨基酸序列的测定。1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。第3章

基因工程2.科技探索之路：基因工程的诞生和发展(P68-69)1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法，为基因序列图的绘制提供了可能。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术---CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。1985年，穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。第3章

基因工程2.科技探索之路：基因工程的诞生和发展(P68-69)1990年，人类基因组计划启动。2003年，该计划的测序任务顺利完成。21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，可以实现低成本测定大量核酸序列，加速了人们对基因组序列的了解。课堂练习基于基因工程的诞生和发展的相关基础理论，判断下列说法的正误。1.1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型，并用实验证明了DNA的半保留复制。（

）2.1970年，在细菌体内发现了第一个限制酶，后来又发现了多种限制酶、DNA连接酶等。（

）3.1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，并构建了第一个体外重组DNA分子。（

）4.1983年，科学家采用花粉管通道法培育了世界上第一例转基因烟草。（

）5.1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育了世界上第一条转基因鱼。（

）×√√×√3.1

重组DNA技术的基本工具从社会中来

番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵害。当番木瓜受到这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？非转基因番木瓜（右）转基因番木瓜(左）实现这一精准的操作过程，至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA的“分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。重组DNA技术所需的三种基本工具”一、限制性内切核酸酶二、DNA连接酶三、基因进入受体细胞的载体一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”:P711.来源：2.作用：主要是从原核生物中分离纯化来的能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。注意作用部位：磷酸二酯键3.结果：黏性末端和平末端（酶专一性）资料卡限制酶名字的由来：P72

限制酶是如何命名的呢？是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的.例如，一种限制酶是从大肠杆菌(Escherichiacoli）的R型菌株分离来的，就用字母EcoR表示;如果它是从大肠杆菌R型菌株中分离出来的第一种限制酶,则进一步表示成EcoRI。例如，流感嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindⅠ、HindⅡ、HindⅢ二、拓展应用1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？

细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子，不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。所以，尽管细菌中含有限制酶，但它自身的DNA也不会被切割，并且可以防止外源DNA入侵。思考：如何将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子？练习与应用：P74P72靠DNA连接酶来完成的。种类______________________________________来源大肠杆菌T4噬菌体作用差别

连接____________和____________

E·coliDNA连接酶T4DDNA连接酶黏性末端平末端

二、DNA连接酶——“分子缝合针”：P72都能将双链DNA片段“缝合“起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。（注意：E·coliDNA连接酶连接平末端的效率较低）思考：P72DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？不是一回事。虽然两者都是催化磷酸二酯键形成的酶，化学本质都是蛋白质，但两者存在显著的区别：区别DNA连接酶DNA聚合酶不同点模板不需要模板需要DNA的一条链作模板作用对象催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键只能催化单个核苷酸加到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键作用结果形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链用途基因工程DNA复制根据所学知识，据图完成以下填空：①限制酶②解旋酶③DNA连接酶④DNA聚合酶ba1.切断a处的酶为_______

2.连接a处的酶为_______3.切断b处的酶为_______①③④②a：磷酸二酯键；b：氢键反馈练习练习与应用：P74C三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”：P721.常用载体：质粒（1）本质：（2）特点：是一种裸露、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。注意：在基因工程中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。这些质粒上常有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。小结：质粒适于做载体的特点（学生朗读）（1）.有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入；（2）.携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；（3）.人工改造的质粒常带有特殊的标记基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，便于重组DNA分子的筛选。2.其他载体：P72-73除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。总结：重组DNA技术的基本工具有限制酶、DNA连接酶和载体；

工具酶:只有限制酶和DNA连接酶。练习与应用：P74A课堂小结：3.1重组DNA技术的基本工具一、限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”1.来源：原核生物(主要)2.作用：能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（体现酶具有专一性的特点）3.结果：黏性末端和平末端二、DNA连接酶——“分子缝合针”E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.常用载体：质粒（本质、特点）2.其他载体：噬菌体、动植物病毒等

高考真题（2024·湖南·高考真题）某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是（）A．限制酶失活，更换新的限制酶B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNAD．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶B酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和PH等，调整酶的用量没有作用，B错误。

探究.实践

DNA的粗提取与鉴定一、实验原理:P74基本思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。1.DNA的提取：DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，可以用酒精初步分离DNA与蛋白质。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。2.DNA的鉴定：DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。DNA+二苯胺沸水浴加热蓝色二、目的要求:P741.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。三、材料用具：P741.材料洋葱菜花香蕉猪肝菠菜2.用具:略

探究.实践

DNA的粗提取与鉴定三、方法步骤:P74-75（学生朗读）1.研磨洋葱：称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，切碎，倒入10mL研磨液，充分研磨。2.过滤获取含DNA的上清液：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，在1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。3.冷却酒精析出DNA：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2~3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。研磨洋葱

探究.实践

DNA的粗提取与鉴定三、方法步骤:P74-754.DNA的鉴定：取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。

探究.实践

DNA的粗提取与鉴定注意事项：1.在将待鉴定的提取物加入2mol/L的NaCl溶液中溶解时，需要不断搅拌以增加溶解的DNA的量，建议搅拌3min以上。2.二苯胺试剂要现配现用，以保证实验效果。加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5min以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应。四、结果分析与评价：P751.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？2.你能分析出粗提取的DNA中可含有哪些杂质吗？（1）观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。（2）二苯胺试剂鉴定呈蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有：所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程出现了失误等。可能含有核蛋白、多糖等杂质。

探究.实践

DNA的粗提取与鉴定四、结果分析与评价：P753.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。

同学们可采取分组的方式进行实验。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种方法提取效果更好。五、进一步探究：P75

本实验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。

探究.实践

DNA的粗提取与鉴定探究.实践

DNA的粗提取与鉴定P74四、结果分析与评价3与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。同学们可采取分组的方式进行实验。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试