病毒蚀斑技术

病毒蚀斑技术

1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virusplaqueformation)成为许多病毒的滴定和研究方法。

(一)原理病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×103，则病毒原液的滴度为：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105(PFU/ml)

(二)技术应用蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。

1.病毒生物学纯化(Virusbiologicalpurification)在进行血清中和试验时,常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性,这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂,或者已有许多变异病毒粒子存在其中,甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时,有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化,应用病毒蚀斑技术,挑选出各个不同的纯化病毒,亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖,测定其滴度,选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化,必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度,一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。

2.蚀斑减少中和试验(PlaqueReductionNeutralizationTest)蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少50％的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作,接种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37℃

1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或纯化

(1)于55mm直径的灭菌塑料培养皿中培养绿猴肾细胞(Vero)，使形成单层。细胞培养时间约3－4天，接种量约为2000000/ml个细胞。选取单层细胞全部覆盖，不留有空洞的培养皿用作试验。

(2)用细胞培养液对AKV病毒作10倍倍比稀释至10-7并保存于4℃。

(3)每个稀释度的病毒液接种3个平皿。

(4)接种前弃去细胞培养液,用5mlPBS或细胞培养液冲洗单层细胞,然后弃去冲洗液。

(5)每个平皿分别加入0.2ml病毒稀释液，对照组只用细胞培养液代替，置37℃二氧化碳培养箱吸附一小时，每15分钟摇动一次，以便使病毒均匀分布。

(6)按第4步骤冲洗未被吸附的病毒。

(7)取2倍浓缩的细胞培养液加入等量的1.5％琼脂(预热)中，每个平皿加入7ml，置平台待冷却凝固后于37℃3%碳酸氢钠2.4ml

双蒸水32.8ml

40ml

(2)两倍浓缩细胞营养液(配制首层琼脂用)10倍199保存液20ml

牛血清4ml

3％碳酸氢钠12ml

1％二乙氨基乙基(DEAE)10ml(可选择)

双蒸水54ml100ml(置40－45℃

精制琼脂糖1.5g

双蒸水加至100ml

(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃水浴备用。)

(4)含中性红两倍浓缩细胞营养液(配制第二层琼脂用)

10倍199保存液20ml

牛血清10ml

3％碳酸氢钠12ml

0.5％中性红6ml

双蒸水52ml

100ml

(置40－45

精制琼脂糖2g

双蒸水加至100ml

(0.112MPa高压灭菌15分钟，置40－45℃（6）结晶紫溶液配置：Crystalvioletstain:stock=1g.crystalviolet

99ml20%EtOH

workingsoluion=20mlstock

40ml95%EtOH

150mldistilledwater---------------------------------------------------------------------------

Crystalviolet-Formaldehydestain:100ml10ml37-40%formalin

90mldH2O

0.4gNaH2PO4(monobasic)

0.65gNa2HPO4(dibasic)

0.1gcrystalviolet计数：Pfu/ml(oforiginalstock)=1/dilutionfactorxnumberofplaquesx1/(mlofinoculum/plate)

----------------------------------EV71Plaqueassay.

RDcells(1×105)in200μlRPMI1640wereseededineachwellofa24-wellplate.Serialdilutionsofthedifferentviralsuspensionswereaddedtothewellsfor18hofincubation.Afterabsorptionfor1hat37°C,thevirussupernatantwasreplacedwithDMEMcontaining2%FBSand0.8%methylcellulosefor72h.Aftertheremovalofthemediumanda15-minfixationstepwith4%formalininPBS,theplaqueswerereadbybeingstainedwith1%crystalviolet.CountswereexpressedasPFUpermilliliter.我也用Viscousmedium做病毒空斑实验，甲基纤维素覆盖培养液具体配方如下，供参考：Inaglassbottle,combine8.8gmethylcellulose(4000centipoise,Sigma)with320mldistilledwater.Stirwithalargemagneticstirrer.Autoclave30minat121℃,leavingthemagneticstirrerinsidethebottle.Removefromautoclavewhilestillhotandstiragainuntilmethylcellulosehascompletelydissolved(usuallyafewhours).Add40ml10×MEMor10×DMEM,40mlFBS,40,000Upenicillin,40mgstreptomycin,and4mlof1MHEPES.AddL-glutamine