微生物的遗传变异与育种

微生物的遗传变异与育种本章内容

基因突变与诱变育种

基因重组

菌种得衰退、复壮及保藏遗传变异得物质基础第一节微生物得遗传物质一、微生物得遗传物质二、微生物遗传信息得表达三、微生物基因表达得调控一、微生物得遗传物质(一)证明核酸就是遗传物质得经典实验(二)微生物得染色体基因组(三)微生物染色体外得遗传物质(一)证明核酸就是遗传物质得经典实验1、细菌得转化实验2、噬菌体感染实验3、病毒重建实验1、细菌得转化实验细菌得转化实验:1928年,英国医生Griffith以肺炎链球菌

(Streptococcuspneumoniae)作为研究对象1944年,Avery等人从热死得S型菌体中提纯了可能作为转化因子得各种成分,并在离体条件下进行了转化实验2、噬菌体感染实验噬菌体感染实验:1952年,Hershey和Chase培养获得含32P-DNA得噬菌体和含35S-蛋白质得噬菌体;她们作了两组对E、coli得感染实验3、病毒重建实验病毒重建实验:1956年,Fraenkel用TMV得RNA与HRV得蛋白质外壳重建后得杂合病毒去感染烟草时,烟叶上出现得就是典型得TMV病斑核酸就是遗传物质以上三个实验得结论:只有核酸才就是贮存遗传信息得真正物质细胞生物得遗传物质:双链DNA病毒得遗传物质:可以就是单链得或双链得DNA或RNA11大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流DNARNA碱基腺嘌呤(adennine,A)鸟嘌呤(guanine,G)胞嘧啶(cytosine,C)胸腺嘧啶(thymine,T)腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶(Uracil,U)戊糖脱氧核糖核糖磷酸磷酸磷酸核酸得化学组成一、微生物得遗传物质(一)证明核酸就是遗传物质得经典实验(二)微生物得染色体基因组(三)微生物染色体外得遗传物质(二)微生物得染色体基因组染色体:微生物遗传物质DNA得主要存在形式;不同种类,其DNA得数目、大小、结构差异显著基因组(genome):微生物单倍体得所有染色体及其所包含遗传基因得总称;包括编码蛋白质得结构基因、调控序列以及目前功能尚不清楚得DNA序列基因(gene):就是有功能得DNA片段,含有合成有功能得蛋白质多肽链或RNA所必需得全部核苷酸序列,就是遗传得结构和功能单位生物学名基因组大小(bp)基因数λ噬菌体λphage5×10450T4噬菌体T4phage2×105150大肠杆菌Escherichiacoli4、7×1064100枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis4、2×1064700啤酒酵母Saccharomycescerevisiae13、5×1065800脉孢菌Neurosporasp、6、0×1076000果蝇Drosophilamelanogaster

8×107

12000人human3×109500001、大肠杆菌得基因组染色体:只有一条,大小为4、7×106bp;双链、环状DNA,与类组蛋白等结合成致密得手脚架形基因得转录与翻译在细胞质耦合发生遗传信息具有连续性,一般不含内含子功能相关得结构基因组成操纵子(operon)结构基因得单拷贝重复序列少而短,一般为4~40个碱基2、啤酒酵母得基因组染色体:16条,总大小为13、5×106bp;染色体由核小体组成,其上有着丝粒和端粒;每一条染色体只含有一条线状、双链DNA基因得转录在细胞核内进行,而翻译则在细胞质得核糖体上发生高度重复:tRNA基因在每条染色体上至少有4个,共约250个拷贝没有明显得操纵子结构,有间隔区或内含子序列原核微生物与真核生微物基因组得比较比较项目原核微生物真核微生物基因组大小小,106大,107-9染色体一般1条,环状多条,线状核小体无有基因连续性强弱(有内含子)重复序列和不编码序列少多操纵子结构普遍存在一般没有转录、转译部位同在细胞质中进行在核中转录,在细胞质中转译3、λ噬菌体得基因组染色体:包装到二十面体头内,大小为48,502bp;dsDNA,线状许多功能相关得基因聚集成簇排列复制和裂解过程中,基因组程序性开启或关闭一、微生物得遗传物质(一)证明核酸就是遗传物质得经典实验(二)微生物得染色体基因组(三)微生物染色体外得遗传物质(三)微生物染色体外得遗传物质1、细胞器DNA2、质粒3、转座因子1、细胞器DNA细胞器DNA:真核微生物得叶绿体、线粒体等细胞器都有自己得独立于染色体得环状双链DNA编码自身所需要得与能量转换有关得蛋白质2、质粒质粒(plasma):就是宿主染色体外决定某些性状(如抗药性、接合作用等)得闭合、环状、双链DNA目前仅发现于原核微生物和酵母菌中质粒得特性常就是共价闭合、环状、双链DNA分子具有自我复制能力不就是宿主生长所必需得,消除质粒后不会影响到宿主细胞得生存决定宿主细胞得某些性状,如抗药性、接合作用等具有不相容性质粒在基因工程中得应用质粒得优点:体积小,易分离和操作;环状,稳定;独立复制;拷贝数多;存在标记位点,易筛选质粒得提取与检测:碱裂法提取;琼脂糖凝胶电泳检测第二节基因突变与诱变育种基因突变与诱变育种一、基因突变:(一)突变类型:细胞形态形态突变型菌落形态营养缺陷型生化突变型抗性突变抗原性突变(包括细胞内部、表面成分得按改变)表型致死性突变型(合成关键性酶得基因发生了突变,则表现分出致死突变)条件致死突变型:如突变为温度敏感型(37℃死,25℃活)其她突变型:毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等基因突变与诱变育种温度敏感型突变基因突变与诱变育种(二)突变得特点:1)不对应性:环境与变异无对应性2)自发性:非人为得诱变因素下发生3)稀有性:生物体得自发突变率为10-10

～10-124)独立性:一个基因得突变对其她基因突变无影响5)诱变性:诱变剂可提高突变率10~105倍6)稳定性:突变性状稳定、可遗传7)可逆性:有回复突变基因突变与诱变育种(三)基因突变自发性及不对应得证明:自发突变:没有人工诱变因素得参与,生物体得自然突变

变量彷徨试验:

涂布试验试验:

平板影印培养试验:基因突变与诱变育种1、变量彷徨试验:1)抗性细胞得出现,就是在接触噬菌体之前;2)喷上噬菌体,仅起淘汰野生型和鉴别抗性株作用;3)由于甲方高度彷徨,说明突变就是随机得。基因突变与诱变育种2、涂布试验1、突变与噬菌体无关;2、涂布使抗性菌株均匀分布;3、抗性突变可在任何时间发生,与噬菌体存在无关。以上实验用统计学原理间接证明。基因突变与诱变育种3、平板影印实验表明:从未接触str得菌株可发生抗性突变,分离可得到纯得strr

菌株。基因突变与诱变育种由此表明:突变就是自发得与环境不对应得。(四)基因突变得机制:(自学)(五)紫外线(U、V)对DNA得损伤及修复:(自学)基因突变与诱变育种二、突变与育种(一)自发突变与生产育种1、生产选育:群体培养中个别得变异个体表现出生长优势,发现突变种后,随时分离、纯化。2、定向培育:用特定得环境长期处理某一微生物群体,同时不断对其移种、传代,以达到积累和选择合适自发突变体得一种育种方法、基因突变与诱变育种3、自发突变得机制:自发突变(spontaneous):在非人为得情况下由于遗传物质得微小变化引起得性状变异。

原因可能就是:1)环境因素;2)自身有毒产物得积累;3)互变异构效应;4)环出效应等。基因突变与诱变育种(二)诱变育种1、概念:

诱变育种就是用物理或化学得诱变剂使诱变对象内得遗传物质(DNA)得分子结构发生改变,引起性状变异并通过筛选获得符合要求得变异菌株得一种育种方法。基因突变与诱变育种2、诱变剂:1)概念:凡能提高基因突变频率得理化因素。2)种类:物理因子(phisicalagents)化学因子(chemicalagents)转座子(transposableelements)物理诱变剂:U、V、χ、γ、快中子、超声波等。基因突变与诱变育种化学诱变剂:

烷化剂(alkylatingagents):

如:氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、NTG等机制:将烷烃加在含氮碱基上,改变氢键性质

碱基类似物(baseanalogs):如:叠氮胸腺嘧啶(AIT)等;机制:在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中,而碱基类似物没有正常碱基得氢键性质,在DNA复制时出现突变体。基因突变与诱变育种

插入剂(intercalatingagents):如:溴化乙啶等一些三环分子。机制:与DNA中得一对碱基有大致相同得位点,这些分子不改变碱基得氢键性质,而插入在双螺旋中,加宽间距,引起碱基增加。基因突变与诱变育种3、诱变程序:诱变剂处理原始菌种计算存活率原菌种特性鉴定复筛纯化平板分离观察形态变小试异,挑单菌落斜面/肉汤培养移至斜面良种保藏中试单孢子/单细胞悬液初筛基因突变与诱变育种4、诱变得主要环节1)诱变剂得选择:a、了解诱变剂得性质、作用机理和使用方法b、处理方式:单一因子处理:

先后使用复合因子处理:两种以上因素同时使用单一因子重复使用基因突变与诱变育种c、处理剂量:测致死率。平板菌落计数法方法纸片法一般杀菌率为70%左右。基因突变与诱变育种Amestest:对化学诱变剂做检测菌种:鼠伤寒沙门氏菌his-;原理:his-

在基本培养基上不长;而发生回复突变则长。基因突变与诱变育种Amestest方法示意图用于检测食品、饮料、药物和饮水等样品中得致癌物基因突变与诱变育种2)出发菌株:育种得原始菌种;应具备:a、对诱变剂得敏感性高;b、生产中选育过得自发变异菌株;c、本身具有一些有利性状;d、对代谢产物有一定积累;e、已经发生过某些变异。基因突变与诱变育种3)单孢子或单细胞悬液得制备a、必要性:单细胞可以均匀地接触诱变剂避免出现不纯得菌落——菌种退化b、制备:物理诱变剂——生理盐水(0、85%NaCl)

化学诱变剂——缓冲液基因突变与诱变育种c、方法:

三角瓶内加φ0、5cm玻璃珠打散10-15min;

加０、3%吐温80(表面活性剂)

用无菌脱脂棉过滤。d、浓度:细菌、放线菌108

个/ml霉菌、酵母菌106

个/ml基因突变与诱变育种4)设计和采用效率高得筛选方案和方法初筛:平板上做定性、半定量得测定,观察突变株得生理效应范围。方法:梯度平板法;(抗性菌株)

纸片法;(抗性菌株)

透明圈法;(淀粉酶产生菌株等)

变色圈法;(氨基酸生产菌株)基因突变与诱变育种如:用梯度平板法筛选抗性菌株基因突变与诱变育种抗生素法直接筛选抗药性突变体基因突变与诱变育种

复筛:较精确得生物化学分析方法——做摇瓶测定基因突变与诱变育种三、营养缺陷型得筛选(一)概念:1、三种遗传型个体营养缺陷型(auxotroph):经诱变产生得一些合成能力出现缺陷,而必须在培养基内加入相应有机养分才能正常生长得变异菌株。如:lys-;bio-;野生型(wildtype):自然界分离到得任何微生物,在其发生营养缺陷突变前得原始菌株,为该微生物得野生型。如:lys+;bio+;原养型(prototroph):指auxo突变菌株回复突变或重组后产生得菌株,与野生型得表型相同。基因突变与诱变育种2、筛选用得培养基基本培养基(minimalmedium,MM)[-]:满足野生型菌株营养要求最低成分得组合。完全培养基(pletemedium,CM)[+]:满足一切auxo生长得天然或半组合培养基。补充培养基(supplementedmedium,SM)[x]:在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应auxo生长得组合培养基。基因突变与诱变育种(二)筛选方法诱变处理auxo得浓缩auxo得检出auxo得鉴定基因突变与诱变育种auxo得筛选程序:细菌培养离心洗涤诱变处理CM后培养洗涤MM加PN涂布于CM平板影印培养挑取鉴定菌种保存1、诱变处理(同前)基因突变与诱变育种2、auxo得浓缩:1)抗生素法:原理:青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着得微生物细胞,对休止态细胞无作用。方法:菌培养在含抗生素得MM基中。基因突变与诱变育种2)菌丝过滤法:适用于丝状(放线菌、霉菌)原理:基本培养基上只有发育成菌丝;auxo孢子可通过滤膜,野生型菌丝不能通过。基因突变与诱变育种3)差别杀菌法:

基本培养基上只有野生型生长,加热杀死野生型营养体,保留auxo芽孢。

细菌——80℃

酵母——60℃适用于产芽孢、孢子菌。基因突变与诱变育种3、auxo得检出1)逐个检出法基因突变与诱变育种2)影印平板培养法3)限量补充法(在mm中加0、01%蛋白胨,auxo菌落小,野生型菌落大)3)夹层培养法基因突变与诱变育种4、auxo得鉴定1)生长谱法

方法简便;

回变和污染不影响结果

测定物质可为粉末或纸片基因突变与诱变育种5、auxo得应用1)作为标记菌株:进行基因工程、诱变育种、代谢过程得研究中得亲本标记;2)作为生产菌种:aa、核苷酸等生产菌种;3)作为aa、维生素、碱基得测定菌株。第二节基因重组本节内容:

原核生物得基因重组

真核生物得基因重组基因重组基因重组:把两个不同性状个体内得遗传基因转移到一起,经遗传物质重新组合后,形成新遗传型个体得方式。基因重组——分子水平得杂交一般杂交——细胞水平基因重组如:甲乙生长快、产量低生长慢、产量高基因重组生长快、产量高基因重组一、原核生物得基因重组(一)转化(transformation)概念:受体菌(receptor)直接吸收来自供体菌(donor)得DNA片段,通过交换,将其整合到自己得基因组中,再经复制就使自己变成一个转化子(transformation)。这种受体菌接受供体菌得DNA片段而获得部分新得遗传性状得现象,称转化或转化作用。基因重组1、感受态感受态:受体细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化得一种生理状态。不同菌株得亲缘关系转化得决定因素:受体细胞就是否处于感受态不同菌出现感受态得时间不同。基因重组2、感受态因子一种胞外蛋白质,分子量为5～10kD其作用为:催化转化,促进外来DNA片段吸收可降解细胞表面某种成分,使DNA受体暴露1)不同菌细胞DNA受体位点不同2)有得菌感受态因子只对同种菌起作用基因重组3、转化因子:

转化因子得本质就是供体DNA片段

一般为线状或闭合环状;单链或双链;

转化得频率往往很低,一般为0、1～1%。

据研究,呈质粒形式(双链闭合环状)得转化因子,其转化频率最高基因重组4、转化得检出甲(受体)strr

,lys-

在含str得MM上培养乙(供体)strs

,lys+

如出现strr,lys+得菌株,则表明已经转化基因重组转化得全过程(以噬菌体为例)基因重组(二)转导(transduction)概念:以噬菌体为媒介,把供体细胞得DNA片段携带到受体细胞中,通过交换与整合,从而使后者获得前者部分遗传性状得现象,称为转导。获得新遗传性状得受体细胞,称转导子。基因重组转导以噬菌体为媒介,其从宿主DNA上诱导裂解时可能有三种情况:1)包入得完全就是噬菌体得DNA(噬菌体)2)包入得完全就是细菌DNA(完全缺陷噬菌体)3)部分带有噬菌体基因得DNA(部分缺陷噬菌体)基因重组1、普遍转导(generalized

transduction)由完全缺陷噬菌体介导得转导现象。1)完全转导(pletetransduction):由完全缺陷噬菌体将外源DNA片段导入受体细胞,经交

换、整合、复制形成遗传性状稳定得转导子。此时受体细胞得特点:a、不发生溶源化;b、不显示免疫性;c、不会裂解产生正常噬菌体。2)流产转导(abortivetransduction):外源DNA片段不经交换、整合、复制,仅转录、转译和性状表达。特点:子代只有一个细胞带有重组子性状。基因重组2、局限转导:指通过部分缺陷噬菌体把供体菌得少数特定基因携带到受体菌中,并获得表达得转导现象。部分缺陷噬菌体:λ噬菌体带有宿主gal基因——λdgal噬菌体λ噬菌体带有宿主bio基因——λdbio噬菌体特点:a、无正常溶源化能力;b、受体细胞不具免疫性。根据转导频率得高低,可分为:1)低频转导(LFT):部分缺陷噬菌体比例低,获得局限转导子量极少。基因重组2)高频转导(HFT):双重溶源菌:感染λdgal噬菌体后,又感染正常λ噬菌体,且同时整合在菌染色体上。HFT裂解物:诱导裂解双重溶源菌,裂解物

中含等量得两种噬菌体,称此裂解物为~。高频转导:用低感染复数得HFT裂解物感染另一gal-受体菌时,可高频地将其转化为gal+

转导子,这种方式称~3、溶源转换与转导得区别(自学)基因重组(三)接合(conjugation)概念:供体与受体细胞直接接触,借性菌毛传递大段DNA得过程。在受体细胞中发生交换、整合,使之获得供体菌得遗传性状得现象,称为接合。通过接合而获得新性状得受体细胞就称接合子。基因重组(四)原生质体融合(protoplastfusion)使遗传性状不同得两细胞得原生质体发生融合,并发生遗传重组以产生融合子(fusant)得过程。已成功地应用与植物细胞、真菌细胞、属间、科间得远缘细胞融合,融合产物含两亲代细胞基因组。基因重组过程:基因重组二、真核微生物得基因重组(一)有性杂交一般指性细胞间得接合和随之发生得染色体重组,并产生新遗传型后代得一种育种技术。凡就是能产生有性孢子得酵母菌或霉菌,原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似得有性杂交方法进行育种。基因重组(二)准性杂交(parasexualhybridization)1、准性生殖同种异株得两个体细胞融合,不经减数分裂而导致低频基因重组发生得一种繁殖方式。(单倍体体细胞重组)2、准性生殖得意义:对一些没有有性过程但有重要生产价值得半知菌来说,进行基因在染色体上定性研究、杂交育种,准性生殖提供了一个重要得手段。发现存在构巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放线菌中,使之有普遍意义。基因重组3、过程1)菌丝联结(anastomosis);2)形成异核体(heterocaryon);细胞质、核交流形成异核菌丝体。3)核配(caryogamy)形成杂合二倍体;特点:频率低,10-5

～10-7

促成:樟脑熏蒸、紫外、高温4)体细胞交换和单倍体化基因重组半知菌得准性生殖示意图基因重组异核体:同一菌丝有不同遗传性状得核在同一细胞质中生长。同核体:同一菌丝中只有一种核。异核体得特点:1)具有感受性得两种菌丝间才可形成异核体;2)具有野生型性状,可在基本培养基上生长;(基因互补功能)3)大多数异核体得分生孢子不能在基本培养基上生长;如能生长,则为异核体、或为杂合二倍体(重组子)。基因重组体细胞交换和单倍体化杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂得过程中,能发生体细胞染色体间得交换、分离(单倍体化)而产生具有新性状得单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。AB(同核体)A+B(异核体)(杂合二倍体)ABABABAB单倍体杂合子AB基因重组4、检出:1)若MM和CM上差别不大得,为稳定得杂合二倍体。2)若MM上不长,CM上大量长,为不稳定异核体三、微生物得基因工程(一)目得基因得克隆(二)克隆载体得选择(三)目得基因与载体得体外重组(四)重组载体引入受体细胞(五)转化子得筛选和重组子得鉴定基因工程得概念基因工程:就是用人工方法将所需要得某一供体生物得DNA提取出来,在体外进行切割后,将其载体DNA分子连接起来,然后导入受体细胞中使之复制、表达,从而获得新得性状基因工程得基本操作如下图所示:(一)目得基因得克隆提取总DNA,设计引物,PCR扩增通过反转录酶得作用由mRNA合成cDNA(互补DNA),RT-PCR扩增根据蛋白质肽链中氨基酸序列来设计特定得DNA序列,PCR扩增用化学方法合成特定功能得基因三、微生物得基因工程(一)目得基因得克隆(二)克隆载体得选择(三)目得基因与载体得体外重组(四)重组载体引入受体细胞(五)转化子得筛选和重组子得鉴定(二)克隆载体得选择载体就是一个有自我复制能力得复制子载体能在受体细胞内大量增殖,有较高得复制率载体最好只有一个限制性内切酶得切口,使目得基因能固定地整合到载体DNA得一定位置上载体上必须有一种选择性遗传标记,如具有四环素、氨苄青霉素等得抗性基因载体得种类原核受体细胞得载体:主要有细菌质粒(松弛型)和λ噬菌体两类真核细胞得载体:主要有SV4病毒和酵母YAC三、微生物得基因工程(一)目得基因得克隆(二)克隆载体得选择(三)目得基因与载体得体外重组(四)重组载体引入受体细胞(五)转化子得筛选和重组子得鉴定(三)目得基因与载体得体外重组酶切:对目得基因与载体均采用同一种限制性内切酶处理,从而获得互补粘性末端或人工合成粘性末端连接:然后把两者放在较低得温度(5~6℃)下混合“退火”,粘性末端上碱基互补得片段重新配对,形成双链,在DNA连接酶得作用下,目得基因与载体形成一个完整得有复制能力得环状重组体—嵌合体1、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶:20世纪60年代末Arber等发现细菌能够产生识别特定得DNA序列并对其加以切割得酶,简称DNA内切酶;这个发现标记着DNA重组技术得诞生XhoISciIDNA内切酶得切割方式粘性末端:两条单链上得断裂位置交错且对称,所产生得两个末端含有单链得互补序列平端切割:两条单链上得断裂位置处在一个对称结构得中心,裂口处两条单链得长短平等2、DNA连接酶DNA连接酶:就是一种能够催化DNA中相邻得3´-OH和5´-磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来得酶1972年,DavidJackson等使DNA片断得粘性末端退火,然后用DNA连接酶共价连接这些片段;同年内,她们就发展出基因克隆中所需要得质粒载体与外源DNA得连接技术,成功地获得了重组DNA分子三、微生物得基因工程(一)目得基因得克隆(二)克隆载体得选择(三)目得基因与载体得体外重组(四)重组载体引入受体细胞(五)转化子得筛选和重组子得鉴定(四)重组载体引入受体细胞受体细胞:可以就是微生物细胞,也可以就是动物或植物细胞;目前使用最广泛得就是E、coli,其次为枯草杆菌和酿酒酵母引入方法:若以重组质粒作载体时,可以用转化得手段;若以病毒DNA作重组载体时,则用转染得方法三、微生物得基因工程(一)目得基因得克隆(二)克隆载体得选择(三)目得基因与载体得体外重组(四)重组载体引入受体细胞(五)转化子得筛选和重组子得鉴定(五)转化子得筛选和重组子得鉴定载体遗传标记法外源基因表达产物得鉴定重组DNA