园艺植物遗传育种 课件 第9、10章 现代生物技术育种；新品种的审定与推广繁育

园艺植物遗传育种第一章

绪论第二章经典遗传与细胞质遗传第三章数量遗传第四章园艺植物种质资源与引种驯化第五章选择育种第六章有性杂交育种第七章杂种优势利用第八章诱变育种第九章现代生物技术育种第十章新品种的审定与推广繁育实训1-15第九章现代生物技术育种9.1概述9.2分子育种的遗传基础

9.2.1两种核酸及其结构9.2.2遗传信息的传递规律9.3基因工程与育种

9.3.1基因工程的原理与技术9.3.2基因工程在园艺植物育种中的应用9.3.3转基因植物的生物安全性及其对策9.4细胞工程与育种

9.4.1胚胎培养技术9.4.2加倍单倍体技术9.4.3原生质体培养和体细胞融合（杂交）技术9.4.4体细胞突变体筛选技术9.4.5植物快繁技术9.5分子标记辅助育种

9.5.1分子标记及其种类

9.5.2分子标记在育种中的应用

练习与思考

本章小结知识目标●了解分子育种的遗传基础●掌握细胞工程的技术方法●了解基因工程的原理与技术以及分子育种技术种类●理解基因工程和分子育种技术在育种实践中的应用能力目标●能应用细胞工程技术进行育种实践操作●能开展园艺植物转基因操作●能正确进行转基因植物的安全性评价9.1概述生物技术（biotechnology），也称生物工程（bioengineering），是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产所需的产品或达到某种目的的一门新兴、综合性学科。该学科主要包括细胞工程（cellengineering）、基因工程（geneengineering）技术和分子标记辅助选择育种（markerassistedselection,MAS）；内容主要涉及组织和器官培养（tissueandorganculture）、体细胞突变体的筛选（mutantsomaticselection）、原生质体培养（protoplastculture）与体细胞杂交（somatichybridization）、单倍体细胞培养（haploidcellculture）、体细胞胚胎发生与生物反应器（somaticembryogenesisandbioreactor）、基因分离和转移（geneisolationandtransfer）以及分子标记辅助选择育种（markerassistedselection，MAS）等技术。

以分子育种为前沿标志的生物技术育种在园艺植物育种领域已得到广泛应用，并逐渐成为改良园艺植物品种、创造和扩繁新种质的捷径。一批高产、优质、多抗、高效新品种脱颖而出。如黄瓜新品种‘北京206’生长势较强，可持续结瓜，适于春、秋大棚及春、秋、冬温室种植；苹果新品种‘七月’适应性广，品质优良，综合经济性状优于‘辽伏’、‘贝拉’等早熟苹果品种。9.2分子育种的遗传基础自ＤＮＡ双螺旋结构被发现以来，随着分子生物学理论与技术的发展，人们直接深入到ＤＮＡ分子水平改造园艺植物或其他动、植物，从而创造新的动、植物品种。这种通过直接或间接运用现代生物技术手段选育新品种的途径，称为分子育种。分子育种技术主要有以下３种：一是选择优良基因进行ＤＮＡ标记；二是用转基因方法转入优良性状的基因；三是通过计算机技术进行分子设计，以实现分子育种的最佳方法。我国的植物分子育种研究计划在主要植物分子标记育种技术体系建设上已取得重要进展：科研人员精细定位、克隆了一批新基因，开发了一批功能标记，奠定了开展分子标记育种的技术基础；获得了调控植物重要性状的遗传网络信息，初步构建了主要作物分子设计数据库及分子模拟系统，并应用于品种分子设计育种；已经成功地创制出一批优异育种新材料和应用于生产的新种质。分子遗传学是分子育种的理论基础，下述内容主要介绍分子遗传学的基础知识。细胞核中的染色体是由核酸和蛋白质组成的，核酸是核苷酸的多聚体，因而它的构成单元是核苷酸。每个核苷酸包括３部分：五碳糖、磷酸和环状的含氮碱基；碱基包括嘌呤和嘧啶。核酸有两种：脱氧核糖核酸（ＤＮＡ）和核糖核酸（ＲＮＡ）。试验证明：大多数生物体都以ＤＮＡ为遗传信息的原初载体；少数ＲＮＡ病毒以ＲＮＡ为遗传信息的原初载体；而蛋白质主要是生物体遗传信息的体现者，与生物体遗传信息所规定的功能息息相关。9.2.1两种核酸及其结构两种核酸的主要区别如下：ＤＮＡ含有的糖是脱氧核糖，ＲＮＡ含有的糖是核糖；ＤＮＡ含有的碱基是腺嘌呤（Ａ）、胞嘧啶（Ｃ）、鸟嘌呤（Ｇ）、胸腺嘧啶（Ｔ），ＲＮＡ含有的碱基前３个与ＤＮＡ完全相同，只有最后１个胸腺嘧啶被尿嘧啶（Ｕ）所代替；ＤＮＡ通常是双链脱氧核糖核酸，ＤＮＡ分子是脱氧核苷酸多聚体。

1953年，沃森和克里克根据Ｘ射线对ＤＮＡ的衍射研究结果以及查格夫（ChargaffE,1951）关于碱基互补配对的原则，阐明了ＤＮＡ分子的空间结构。一个ＤＮＡ分子有两条多核苷酸链，这两条链的走向是相反的，一条是从５′到３′，另一条是从３′到５′，二者呈逆平行状态形成右手双螺旋结构。在双螺旋内侧，腺嘌呤与胸腺嘧啶之间配对，形成两个氢键（Ａ==Ｔ）；鸟嘌呤与胞嘧啶之间配对，形成３个氢键（Ｇ==Ｃ）。各对碱基之间的距离为0.34ｎｍ，每转一圈长为3.4ｎｍ，包含10个碱基对，螺旋直径２ｎｍ（图9.2.1）。尽管绝大多数ＲＮＡ都是单链的，但在ＲＮＡ分子内某些片段也可通过腺嘌呤与尿嘧啶之间配对（Ａ==Ｕ），鸟嘌呤与胞嘧啶之间配对（Ｇ==Ｃ），形成“发夹”状结构（图9.2.2）。ＤＮＡ分子的物种特异性主要决定于ＤＮＡ分子中４种碱基的比例和排列顺序。（１）不同生物的ＤＮＡ其碱基比例（Ａ＋Ｔ）／（Ｇ＋Ｃ）是不同的，虽然各种真核生物ＤＮＡ的碱基都是Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ４种，但（Ａ＋Ｔ）／（Ｇ＋Ｃ）比例却不同：高等植物和动物往往Ａ＋Ｔ较多，而且在平均碱基组成上相对一致，但在较低等的真核生物中，（Ａ＋Ｔ）／（Ｇ＋Ｃ）比例的差异就比较大。（２）４种碱基在一条多核苷酸链上排列的形式是多种多样的，组成ＤＮＡ的碱基尽管只有４种，但对任何一个ＤＮＡ碱基位点来说，均有４１＝４种排列方式，即Ａ—Ｔ、Ｔ—Ａ、Ｇ—Ｃ、Ｃ—Ｇ；对两个碱基位点来说，就有４２＝１６种排列方式；由n个核苷酸连接的核苷酸链，就有４n

种排列，即可以构成４n种不同性质的基因，从而使生物性状表现得千差万别。中心法则（geneticcentraldogmaｇ）是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从ＲＮＡ传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程；也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。这是所有具细胞结构的生物所遵循的法则。在某些病毒（如烟草花叶病毒等）中的RNA自我复制和在某些病毒（某些致癌病毒）中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程是对中心法则的补充。细胞的遗传物质都是DNA，只有一些病毒的遗传物质是RNA。这种以RNA为遗传物质的病毒称为反转录病毒（retrovirus），在这种病毒的感染周期中，单链RNA分子在反转录酶（reversetranscriptase）的作用下，可以反转录成单链DNA，然后再以单链DNA为模板生成双链DNA。双链DNA可以成为宿主细胞基因组的一部分，并同宿主细胞的基因组一起传递给子细胞。在反转录酶催化下，RNA分子产生与其序列互补的DNA分子，这种DNA分子称为互补DNA（complementaryDNA），简写为ｃDNA，这个过程即为反转录（reversetranscription）。9.2.2遗传信息的传递规律9.2.2.1中心法则及其发展朊粒是一种蛋白质传染颗粒（Proteinaceousinfectiousparticle），它最初被认识到是羊瘙痒病的病原体。研究证明，朊粒不是病毒，而是不含核酸的蛋白质颗粒。一个不含ＤＮＡ或ＲＮＡ的蛋白质分子能在受感染的宿主细胞内产生与自身相同的分子，且实现相同的生物学功能，即引起相同的疾病，这意味着这种蛋白质分子也是负载和传递遗传信息的物质。试验证明，朊粒不是传递遗传信息的载体，也不能自我复制，而仍是由基因编码产生的一种正常蛋白质的异构体。因此中心法则可用下图(图9.2.3）表示。ＤＮＡ的复制过程非常复杂。首先，在复制起点处ＤＮＡ解旋酶将双链ＤＮＡ解旋，形成复制叉，ＤＮＡ复制过程中，随着两条子链的延长，复制叉不断前移。子链ＤＮＡ总是按５′向３′的方向进行合成，亲链中原５′向３′的链复制时是连续合成的；而原３′向５′的链按冈崎片段复制，再由ＤＮＡ连接酶将其连接成子链。复制后每一个新的双链ＤＮＡ分子都是由一条亲链和一条新合成的子链组成（半保留复制）。由于ＤＮＡ的半保留复制是严格地按照碱基配对原则进行的，因此，新合成的子链ＤＮＡ忠实地保存了亲链ＤＮＡ所携带的全部遗传信息。通过这样的复制，基因便能够代代相传，准确地保留下去。9.2.2.2

DNA复制与修复ＤＮＡ复制时可能由ＤＮＡ聚合酶引发偶然错误，或者由于环境因素（如辐射、致突变的化学物质诱发）致使ＤＮＡ产生序列上的错误，此时生物体内的修复系统就会对ＤＮＡ变异起保护修复作用。ＤＮＡ修复主要包括３个步骤：①ＤＮＡ修复核酸酶对ＤＮＡ链上不正常碱基的识别与切除；②ＤＮＡ聚合酶对已切除区域的重新合成；③ＤＮＡ连接酶对剩余切口的修补。但ＤＮＡ的损伤或突变也不可能全部被修复，否则就不存在变异，生物也就不可能进化了。因此遗传是相对的，变异是绝对的，这是生物进化过程中的必然现象。ＤＮＡ结构在一些特殊的条件下（如高温及强碱），双链ＤＮＡ分子的氢键断裂，两条链完全分离，形成单链ＤＮＡ分子，这种情况称为ＤＮＡ变性（denaturation）。变性的ＤＮＡ分子经处理又可重新形成正常的ＤＮＡ分子，这个过程称为复性（renaturation）或退火（annealing）。降低温度、ｐＨ及增加盐浓度均可促进ＤＮＡ分子的复性（退火）。当复性的ＤＮＡ分子由两条不同的单链形成时，这种复性称为杂交（hybridization）。9.2.2.3

DNA变性、杂交遗传的稳定性对于维持生物的生存是很重要的，但生物体的生存必须适应环境变化，因此生物体的ＤＮＡ就会发生一些变异来适应新环境，这是生物进化的原动力。生物遗传的变化来自ＤＮＡ的重新排列，即基因重组。基因重组具有重要的生物学意义。正是由于ＤＮＡ的变异、基因重组产生新的生物性状甚至形成新物种，从而使人为地改变生物的遗传特性成为可能，以获得符合人类要求的生物新特性和生物新个体，这就是基因工程。9.2.2.4

基因重组9.3基因工程与育种植物基因工程（plantgeneticengineering）是指按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外ＤＮＡ重组和转移等技术，有目的地改造植物种性，使现有物种在较短时间内趋于完善，创造出新种质的过程。它是近30年来随着ＤＮＡ重组技术、遗传转化技术及离体培养技术的发展而兴起的生物技术。转基因作物综合其性状表现为抗虫、抗除草剂、抗逆境等，其品质得到改良、生长发育得到调控、产量潜力大幅度提高，产生了巨大的经济、社会和生态效益。根据国际农业生物技术应用服务组织（ＩＳＡＡＡ）公布的数据，批准种植转基因作物的国家从1996年（商业化的第１年）的６个增加到2003年的18个，2009年种植转基因作物的国家达到25个，种植面积达1.34亿公顷，比2008年增长７％。基因工程的４要素包括外源ＤＮＡ、受体细胞、载体分子和工具酶，它们是基因工程研究的主要内容。（１）外源ＤＮＡ从分子本质上讲，所有的基因都具有相同的化学本质，因此无论是微生物、植物和动物的ＤＮＡ都可以作为另一种生物的外源ＤＮＡ。目前，目的基因主要来源于真核生物染色体组。原核生物的染色体组也有几百上千的基因，也是目的基因的来源。此外，一些核外遗传物质，如质粒基因组、病毒基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组等也有少量基因，可作为进行与之相关研究时的目的基因。9.3.1基因工程的原理与技术9.3.1.1

基因工程的要素（２）受体细胞大肠杆菌、枯草杆菌、酵母等低等生物体以及各种植物、动物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。但是需要这些受体细胞具备在试验技术上能够摄取外源ＤＮＡ，并使目的基因稳定存在下去；在试验目的上是具有应用价值并具有高品质性状的细胞；同时一个良好的受体细胞还应具有较高的安全性，能高效表达目的基因，便于筛选重组体等特点。（３）载体分子基因工程中，携带目的基因进入受体细胞进行扩增和表达的工具称为载体。载体主要有以下几类：质粒载体、病毒载体、酵母人工染色体（ＹＡＣ）载体。①限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链ＤＮＡ分子中的某种特定核酸序列，并由此切割ＤＮＡ双链结构的酶。如：EcoＲⅠ、BamＨⅠ、BglⅡ等都是基因工程常用的限制性核酸内切酶。②ＤＮＡ聚合酶ＤＮＡ聚合酶的共同特点在于，它们都能够以ＤＮＡ为模板，把脱氧核苷酸连续地加到双链ＤＮＡ分子引物链的３′－ＯＨ末端，催化核苷酸的聚合作用。ＤＮＡ聚合酶Ⅰ、Ｋｌｅｎｏｗ聚合酶和耐热的ＴａｑＤＮＡ聚合酶等都是常用的ＤＮＡ聚合酶。

③连接酶ＤＮＡ连接酶能够催化在两条ＤＮＡ单链之间形成磷酸二酯键。目前基因工程中常用的是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４连接酶。④反转录酶一种依赖于ＲＮＡ单链为模板，通过ＤＮＡ聚合作用形成的ＤＮＡ聚合酶类。基因工程的操作过程大体包括以下几个主要步骤。（１）取得或制备目的基因获得目的基因的途径很多，如可以从植物基因组中利用限制性内切酶直接分离出带有目的基因的ＤＮＡ片段；可以利用PCR技术从复杂的基因组扩增出基因；或者利用ＤＮＡ合成仪人工化学合成目的基因的ＤＮＡ片段，获得ＤＮＡ片段完整的目的基因等。9.3.1.2

基因工程的操作步骤（２）构建重组载体将要克隆的ＤＮＡ分子通过黏性末端连接、平整末端连接、同聚末端连接或人工分子连接等方法，与载体ＤＮＡ分子连接起来，形成重组ＤＮＡ分子。构建重组ＤＮＡ时应注意连接一个控制目的基因转录表达的启动子、一个控制目的基因转录终止的终止子和一个编码特殊性质蛋白质的选择标记基因。（３）基因扩增将构建好的含有外源基因的重组载体导入对应细菌中，利用细菌扩增重组ＤＮＡ，达到基因扩增的目的。（４）重组ＤＮＡ分子导入受体细胞常用的方法有化学刺激法、电击法、基因枪法、花粉管导入法、根瘤农杆菌Ｔｉ质粒介导法（图9.3.1）、Ｒｉ质粒介导法及植物病毒载体介导法等。植物遗传转化中最常用的是基因枪法、农杆菌Ｔｉ质粒法。通过上述方法，将重组ＤＮＡ分子成功导入受体细胞。目标植物的细胞受体系统可以是植物组织、植物体细胞或原生质体甚至是花粉细胞、卵细胞等生殖细胞。（５）检测和培养通过选择标记基因可以检测经过遗传转化的细胞和植物组织，在合适的培养基上培养这些细胞和组织，使之形成大量的转基因小苗。转基因小苗还需要进行检测，目前对转基因植株的鉴定有ＤＮＡ的Southern杂交（检测外源基因是否整合到植物染色体上）、Northern杂交（检测外源基因是否在转录水平上表达）以及Western杂交（检测外源基因是否在翻译水平上表达）或酶活性分析等方法，可根据目的和条件选用合适的方法。最好还要开展转基因当代和后续世代的田间目标性状的测定。检测过程中均需设立对照。（６）转基因植物的大规模种植从转基因植物中选出目的基因表达量高、综合性状优良的品种进行大规模种植。9.3.2基因工程在园艺植物育种中的应用从1983年首例转基因植质改良、生物反应器等方面。迄今国内、外批准商业化应用的各类转基因植物已近90种，仅美国和加拿大就超过50种。全球种植的大豆、玉米、棉花和卡诺拉油菜中有１/５以上是转基因作物。基因工程在园艺植物育种上的应用目前主要有以下几个方面。9.3.2.1创造园艺植物新种质通过基因工程可创造常规育种手段难以获得的园艺植物新种质。例如，通过揭示控制花瓣色彩的各种色素的生化合成过程，分离出与花色素合成有关的一些关键基因，并将其转入观赏园艺植物中，从而为创造园艺植物新种质开辟了道路。湖北大学生命科学院研制出一种荧光促进剂，通过科学“诱导”，激发植物体内潜在发光物质发出荧光。无论是名贵的兰花，还是普通的月季或菊花，在花朵含苞待放时，只需将这种特制的荧光促进剂喷洒在花瓣上１次，这种花卉整个花期内都会在黑暗中发出荧光。另外，科学家对花瓣条纹、彩斑等方面的研究也取得很大进展。日本三得利（Ｓｕｎｔｏｒｙ）公司于２００４年６月３０日公布了世界首株成功开发的蓝色玫瑰花的消息，该株玫瑰花的花瓣中所含的色素为蓝色，纯度接近１００％。9.3.2.2改良品质一般粮食种子的储存蛋白质中几种必需氨基酸的含量较低，直接影响到人类主食的营养价值。例如，禾谷类蛋白质的赖氨酸含量低，豆类植物的甲硫氨酸、胱氨酸、半胱氨酸含量低，将富含赖氨酸和甲硫氨酸的蛋白质编码基因植入玉米中，可显著提高其营养价值。目前已经推出‘ＧｏｌｄｅｎｒｉｃｅⅡ’，该品种是将水仙花中的两个基因和细菌中的一个基因一起导入水稻基因组，使水稻中的铁元素、锌元素和维生素Ａ的含量提高，有效防止贫血和维生素Ａ缺乏症。康乃馨花期较短，为了延长花期，澳大利亚的生物技术专家在康乃馨植株中引入一种基因，使花期延长１倍，提高了观赏性。9.3.2.3提高抗病虫能力用基因工程技术提高植物抗病虫能力是十分有效的。荷兰一家植物生物技术公司应用转基因技术培育出一种抗真菌草莓新品种，减少了草莓病害，并延长了草莓保鲜期，经济效益明显增加。苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）基因表达产物为毒性蛋白质，对鳞翅目和鞘翅目的昆虫（如小菜蛾）有很强的杀伤作用，但对脊椎动物无毒，该基因被转入棉花、杨树、油菜等植物中，使植物的抗虫能力极大提高。雪花莲凝集素（galanthus

nivalisagglutining，GNA）是目前与害虫治理有关且研究得比较多的一种单子叶植物甘露糖结合凝集素，GNA对同翅目的蚜虫、叶蝉和稻飞虱表现出一定的毒杀作用，对咀嚼式口器的害虫表现出中等毒杀作用，但对哺乳动物基本无毒。近年来，人们采用基因工程的方法，将GNA基因导入水稻、烟草、小麦、玉米、莴苣、棉花、番茄、甘蔗、大白菜、油菜、新疆甜瓜等粮食或经济作物中，结果表明，转基因植株对同翅目的蚜虫表现出较好的防治效果。9.3.2.4改善抗逆性植物对外部环境的适应能力可通过基因工程技术大幅度提高。将热激蛋白质基因经过一定改造后导入植物，可大幅度提高其抗热性，拓展种植范围。常用耐受胁迫相关的基因有编码甘露醇的mtID

基因和编码山梨醇的gutD

基因；真核生物的海藻糖合成酶基因Tps１和Tps２；催化谷氨酸合成脯氨酸的P5CS基因；合成甘氨酸甜菜碱的胆碱脱氢酶（ＣＤＨ）和胆碱氧化酶（ｃｏｄＡ）的基因等。这些基因的产物都能提高植物细胞的渗透压，提高植物抗寒、抗冻、耐旱、耐盐的能力。据报道，哈尔滨师范大学将深海鱼美洲拟鲽的抗冻基因通过柱头导入番茄，获得可耐受-５～-４℃低温的转基因番茄。9.3.2.5提高光合作用和固氮效率通过提高二氧化碳固定反应中的二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）的活性，降低其加氧酶活性，可显著提高光合生产率。Rubisco是由叶绿体基因编码的８个大亚基（ｒｂｃＬ）和由核基因编码的８个小亚基（ｒｂｃＳ）组成的，将不同植物的Rubisco导入植物细胞形成杂合亚基酶分子或诱导点突变，修饰酶活性可达到提高光合效率的目的。把生物固氮的基因工程运用于农业生产，目标主要有两个：一是把非豆科作物，尤其是禾谷类作物转变成固氮作物；二是提高现有固氮作物的固氮能力。1982年，Dwjong等率先把根瘤菌共生质粒（携有共生基因）的转移应用到育种中去，他们将豌豆根瘤菌128Ｃ53中的共生质粒ｐＩＪ1008导入豌豆根瘤菌300菌株中，经盆栽结瘤试验证明可使后者接种植株的固氮量增加３０％、干重增加１５％。此后，在大豆、菜豆、紫云英等植物中都进行了类似的研究，发现接受了外源共生基因的根瘤菌的竞争结瘤能力及固氮酶活性的确有明显变化，有的提高，有的降低。因此，阐明外源共生基因的作用机制以及寻找合适的外源共生基因的供体和受体是很有必要的。9.3.2.6创建雄性不育材料

1992年，Ｗorral等用编码β－１，３－萄聚糖水解酶基因转化烟草、矮牵牛获得雄性不育植株。1993年，LeemansＪ将核糖核酸酶基因嵌合到油菜染色体中，使其只在花药的毡绒层中专性表达引起油菜雄性不育。目前，已发现许多可导致植物雄性不育的基因，正在进行开发利用。9.3.2.7延迟成熟与保鲜果实细胞壁降解与果胶酶（多聚半乳糖醛酸酶ＰＧ和果胶甲酯酶ＰＥ）活性有关，通过ＰＧ和ＰＥ的克隆和反义遗传转化所获得的番茄转基因植株，其果实中ＰＧ和ＰＥ的活性受到显著抑制，从而延迟果实的成熟。美国Ｃａｌｇｅｎｅ公司将ＰＧ反义基因导入番茄，培育成转基因新品种‘Ｆｌａｖｓａｖｒ’于1994年被批准上市。1996年，叶志彪等通过用反义基因抑制ＡＣＣ合成酶的表达活性，抑制乙烯的合成，从而育成耐贮藏的转基因番茄。9.3.2.8选育抗除草剂品种

1987年，科学家成功地从矮牵牛中克隆出在芳香族氨基酸生物合成中起关键作用的ＥＰＳＰ合成酶的基因，转入油菜后，其叶绿体中ＥＰＳＰ合成酶的活性大大提高，对ＥＰＳＰ合成酶起抑制作用的高效广谱灭生性除草剂草甘膦产生有效抗性。通过把降解除草剂的蛋白质编码基因导入宿主植物，从而保证宿主植物免受其害的方法已引起重视，并在烟草、番茄、马铃薯、油菜、大豆、杨树中获得转基因抗磷酸麦黄酮类除草剂的品种等。美国一家生物技术公司推出了转基因的匍匐翦股颖对草甘膦具有抗药性，种植者可以完全放心地将草甘膦喷洒在抗性翦股颖草坪上，在杀死杂草的同时，不用担心翦股颖会受到伤害。转基因作物耐农达ＲＲＲ除草剂甜菜在美国和加拿大已经实现了商业化。9.3.2.9植物生物反应器

利用转基因植物作为生物反应器生产药用蛋白质的研究逐渐受到各国的重视，研究探索的热点之一是利用转基因植物生产口服疫苗。中国农业科学院生物技术研究所的科研人员将乙型肝炎病毒表面抗原基因导入马铃薯和番茄，通过饲喂小鼠试验检测到较高的保护性抗体，浓度足以对人类产生保护作用。该所还进行了利用植物叶绿体作为生物反应器生产药用蛋白质的探索，目前已将丙肝病毒（ＨＣＶ）抗原基因导入衣藻叶绿体。利用转基因植物生产口服疫苗可以大大降低疫苗的生产成本，在发展中国家更有良好的发展前景。随着我国1986年11月启动实施了“高技术研究发展计划”（863计划），转基因的研究步伐加快。21世纪植物转基因技术对于我国农业的可持续发展和食物安全将发挥重要的作用。从目前情况看，抗虫、抗除草剂基因工程产品开发较快，抗病基因工程的研究开发需要进一步深入，抗逆、改良品质、生长发育等基因工程还有待基础研究及取得新的突破。9.3.3转基因植物的生物安全性及其对策转基因作物在进行商品化生产之前，必须进行转基因生物安全性评价，必须完成各种安全评价程序和试验环节。研发单位在申请安全性评价时提交该转基因作物详尽的分子生物学资料，并通过国家指定的具有资质的机构进行食品安全性评价；同时还要通过中间试验、环境释放、生产性试验等一系列田间试验，获得生态环境安全性的资料，全过程一般需要６～８年。全部项目通过安全委员会综合评价以后须经农业部批准商品化生产，确保转基因作物的食品和生态环境安全。9.3.3.1转基因植物的环境安全性环境安全性评价要回答的核心问题是转基因植物释放到田间去是否会将基因转移到野生植物中，或是否会破坏自然生态环境，打破原有生物种群的动态平衡。国内、外专家对于转基因给土壤生物和生物多样性带来的影响研究不多，但该问题也备受关注。Ｓａｘｅｎａ等发现Bt杀虫蛋白质可以通过根部渗出物进入土壤中，并且在适宜的土壤中持久的保持杀虫活性。总之，转基因植物的大规模种植，会对生物群落造成或多或少或直接或间接的影响。转基因的逃逸是指导入植物的目的基因向野生的近缘种等非目标生物流动。如果抗除草剂植物的花粉将基因转移到杂草中，将产生具有抗除草剂特点的“超级杂草”；外源基因随花粉、风、雨、鸟、昆虫、细菌扩散到整个生物链体系中，则可能对非靶生物造成基因污染而无法清理，只能永远繁殖下去；转基因植物在生存竞争上具有优势，导致生态系统生物多样性降低。因此，我们必须严格控制被转基因，以防其逃逸到自然环境中去。如使用安全载体和受体，造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离等。这样，转基因生物在进入自然环境中以后就不可能自行繁殖，因此也就不可能对生态系统造成长期的影响。抗病毒转基因植物的风险主要是病毒的重组和异源包壳问题。对于导入植物体的病毒外壳蛋白质对人和其他生物本身是无害的，但是一旦它包装了其他的病毒核酸，则可能产生病毒重组的潜在危险。目前，已采取了一些措施防止重组病毒的产生，如限制导入基因的长度、禁止使用产生功能性蛋白质的基因等。9.3.3.2转基因植物的食品安全性食品安全性也是转基因植物安全性评价的一个重要方面。经合组织于１９９３年提出食品安全性评价的实质等同性原则。即如果转基因植物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的；如转病毒外壳蛋白质基因的抗病毒植物及其产品与田间感染病毒的植物生产的产品都带有外壳蛋白质，这类产品应该认为是安全的；若转基因植物生产的产品与传统产品不存在实质等同性，则应进行严格的安全性评价。在进行实质等同性评价时，一般需要考虑以下两个方面的问题。（１）有毒物质必须确保转入外源基因或基因产物对人畜无毒。如转Bt杀虫基因玉米除含有Bt杀虫蛋白质外，与传统玉米在营养物质含量等方面具有实质等同性。要评价它作为饲料或食品的安全性，则应集中研究Bt蛋白质对人畜的安全性。目前，已有大量的试验数据证明Bt蛋白质只对少数目标昆虫有毒，对人畜绝对安全。（２）过敏源在自然条件下存在许多过敏源。在基因工程中如果将控制过敏源形成的基因转入新的植物中，则会对过敏人群造成不利的影响。所以，转入过敏源基因的植物不能批准商品化生产。如美国有人将巴西坚果中的２Ｓ清蛋白基因转入大豆，虽然使大豆的含硫氨基酸增加，但也未获批准进入商品化生产。另外还要考虑营养物质和抗营养因子的含量等。9.3.3.3转基因植物生物安全性问题的对策对于转基因植物的生物安全性问题，应排除狭隘的商业利害和信仰偏见的干扰，在目前科技水平还难以精确预测全部后果的情况下，采取避害趋利的必要措施。现将有关方面已经提出的策略、措施介绍如下：（１）深化和完善转基因技术为了避免转基因带来的风险，应不断完善转基因过程中的相关技术。如采取转入双价基因的方法，即同时转入目的基因和雄性不育基因，来阻断转基因植物花粉传播可能带来的外源基因扩散问题；为了防止转基因过程中采用标记基因造成的生物安全问题，开展有关无标记遗传转化系统的开发和研究等。（２）加强对遗传工程生物体及其产品的安全性和其他可能产生的危害进行研究研究和开发转基因产品过程中，必须加强其安全性防范的长期跟踪研究。（３）建立完善的检测体系和质量审批制度为确保转基因产品进出口的安全，必须建立一整套完善的、既符合国际标准又与我国国情相适应的检测体系，构建严格的质量标准审批制度。审批机构应独立于研发机构之外，也不应受到太多的行政干预。（４）不断完善相关法规转基因产品安全性法规的建立和执行应该以严格的检测手段为基准，同时应培养一批既懂生物技术知识、又能驾驭法律的专门人才。（５）加强宏观调控有关决策层应对转基因产品的产业化和市场化速度进行有序调控。任何转基因产品安全性的防范措施都必须建立在对该项技术的发展进行适当调控的前提下，否则在商业利益的驱使下只能是防不胜防。（６）加强对公众的宣传和教育，为公众提供良好的咨询服务通过多渠道、多层次的科普宣传教育，培养公众对转基因产品及其安全性问题的客观公正意识，从而培养对转基因产品具有一定了解、认识和判断能力的消费者群体。这对于转基因产品能否获得市场的有力支撑是至关重要的。同时，应该设立足够数量的具有高度权威性的相关咨询机构，从而为那些因缺乏专业知识而难以对某些转基因产品作出选择的消费者提供有效的指导性帮助。（７）规范转基因产品市场必须培育健康、规范的转基因产品市场。转基因产品的安全性决定其在市场中的发展潜力。因此，有关转基因产品质量及其安全性的广告宣传应该具有科学性和真实性。一旦消费者因广告宣传而受误导或因假冒产品而被欺骗，转基因产品就会因消费者的望而生畏从而失去市场。9.4细胞工程与育种植物细胞工程是以植物细胞全能性为理论基础，以植物组织与细胞培养为技术支持，在细胞和亚细胞水平对植物进行遗传操作，实现植物改良和利用或获得植物来源的生物产品的生物技术。植物细胞工程主要包括植物组织培养技术、胚胎培养技术、体细胞突变体筛选技术、原生质体培养与细胞融合（体细胞杂交）技术、加倍单倍体技术等。近年来，这些技术及其与常规育种技术的有效集成在快速繁育、种质保存、品种选育和遗传改良等许多领域得到广泛应用，显示出巨大的潜力。9.4.1胚胎培养技术植物胚胎培养是胚、胚珠、子房和胚乳的离体培养技术，其应用领域包括胚胎的发育机制、克服杂交不亲和性、胚拯救、克服珠心胚的干扰、打破种子休眠、获得体细胞胚和人工种子、建立植物高效再生体系等，并在农作物、园艺作物、林木和药用植物上广泛应用。9.4.1.1胚培养胚胎发生过程是从合子进行第１次分裂开始，由未分化到分化直到分生组织形成、幼胚建立的连续渐进变化的过程。不同发育阶段的胚培养要求不同的培养条件，温度和光照等环境条件也会影响到成败。在子叶期之前的幼胚培养成功率与胚的大小有密切关系，多数研究表明，胚龄大小与成功率呈正相关，小于0.5ｍｍ的幼胚很难进行培养。在未成熟胚胎的培养中，常见有３种明显不同的生长方式：第１种是继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；第２种是在培养后迅速萌发成幼苗，而不继续进行胚性生长，通常称为“早熟萌发”；第３种是在许多情况下先形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基，这种胚性愈伤组织是建立细胞悬浮培养系或分离原生质体的良好原始材料。9.4.1.2胚珠和子房培养胚珠培养时，外植体的选取应注意胚珠授粉的天数，对于球形胚或发育程度更高的胚珠，通过培养较易得到成熟种子。Maheshwari等将授粉６天后的罂粟离体胚珠进行培养，获得了有生活力的种子。培养基的渗透压会影响离体胚珠的发育，这对于较细嫩的胚珠更需强调之。如矮牵牛授粉后５天的球形期胚珠，在含４％～１０％（质量分数）的蔗糖培养基中较合适；而对于合子胚期的胚珠，最适的蔗糖浓度为６％（体积分数）；若在受精后进行培养，其蔗糖最适浓度为８％（体积分数）。此外，胎座对于胚珠培养也十分重要。

1942年，RueＬ首次开展了被子植物子房的培养；1951年，Nitsch成功培养了黄瓜、草莓、番茄、烟草和菜豆等的离体胚，从而奠定了子房培养技术。维生素和植物激素对于子房培养有显著作用。Maheshwari等以授粉１天的屈曲花子房为外植体，在含无机盐和蔗糖的培养基上发现胚比自然形成的小；而在培养基中添加维生素Ｂ后，则获得正常大小的果实；若再在培养基中添加ＩＡＡ，果实比自然形成的还大。天然植物提取物对于子房培养也有作用，如在莳萝和天仙子的合子期或双细胞原胚期的子房培养中，培养基中若添加椰子汁，其果实大小可超过天然果实。9.4.1.3胚乳培养在胚乳培养中，产生愈伤组织或胚状体的能力与胚乳发育的时期有密切的关系，一般而言，处于旺盛生长期的胚乳最易诱导产生愈伤组织。但不同植物也有不同，苹果、柚、黄瓜等未成熟胚乳培养比较适宜的时期是在授粉后７～１４天，超过一定时期则不能诱导愈伤组织；而巴豆、麻疯树、变叶木、荷叶芹等都需要在胚乳成熟期进行培养，不仅诱导出愈伤组织，还有器官分化。胚乳培养常用的基本培养基有White、ＭＳ和ＭＴ等，其中ＭＳ培养基用得最多。培养基中添加一定的天然提取物有利于获得成功，如变叶木和葡萄的胚乳培养，若加一定量的椰子汁对于愈伤组织的诱导和生长是必需的。胚乳培养的主要目的是获得具有利用价值的三倍体植株。1973年，印度的Srivastava首次从罗氏核实木的成熟胚乳成功培养出三倍体再生植株。目前，有40多种植物的胚乳培养达到了不同程度的细胞分化和器官分化，不少植物已得到再生植株。我国在马铃薯、小麦、水稻、苹果、桃、猕猴桃等10多种植物上得到了胚乳再生植株。胚乳培养还可作为研究淀粉等营养物质合成和代谢的试验体系。通过胚乳培养产生的一些非整倍体，可以作为遗传分析的材料。但相对于其他植物器官、组织和细胞的培养，胚乳培养相对较难，故应用并不普遍。9.4.1.4离体授粉、受精植物离体受精可以通过离体柱头授粉、离体子房授粉、离体胚珠授粉、离体精细胞和卵细胞融合等方法实现。该技术可以克服植物杂交不亲和的问题，同时也可以进行胚胎、种子和果实发育机制等基础研究。人工分离的精细胞和卵细胞融合后进行合子胚培养，已在玉米等植物上获得成功。植物离体受精技术是植物细胞工程中的重要试验技术，为研究植物胚胎发育机制提供了新的试验系统，为开发新的植物转基因途径提供了可能。9.4.2加倍单倍体技术加倍单倍体技术（doublehaploidtechnology）是指利用植物组织培养技术培养单倍体植物材料（花药、花粉、未受精的子房和胚珠）获得单倍体植物，然后通过自然或人工加倍的方法获得双倍体植株的技术，其中以花药和花粉培养应用最为广泛。9.4.2.1花药培养在离体培养条件下，要使花药中的花粉改变其正常发育方向而形成单倍体植株，需要各种因素来共同调节和控制。外因方面与培养基成分、植物生长调节剂种类、糖浓度、培养温度和光照有关；内因主要决定于花药中花粉发育的时期，最适宜的时期因植物种类和品种而不同，一般从单核早期到双核期。此外，供体植株的生长条件和植株年龄也会影响花药的培养。在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的植株，常有倍性变异。形成非单倍体的原因有核融合、不正常的非单倍体花粉诱导生长、花药壁和花丝等参与愈伤组织的形成等。为此，可采取花粉培养方法或控制激素水平，抑制体细胞组织的发育而促进小孢子的发育。9.4.2.2花粉（小孢子）培养花药中的小孢子母细胞通过减数分裂形成小孢子，小孢子核分裂形成生殖细胞和营养细胞后成为雄配子体，即成熟花粉。通常我们把小孢子和雄配子体统称为花粉。花粉培养实际上包括单核期花粉培养、双核期花粉培养和成熟花粉培养３种。严格地讲，小孢子只包括四分体解离后至第１次核有丝分裂时期的细胞，“小孢子培养”单指单核期花粉培养。但是，在培养工作中，由于花粉培养以小孢子培养为主，有时也将花粉培养与“小孢子培养”通用，将双核期花粉培养甚至成熟花粉培养等统称为“游离小孢子培养”。花粉培养主要应解决好花粉的分离及其培养两个环节。分离花粉的方法有机械分离法和自然散落法两种。常用的花粉培养方法主要有浅层液体培养法、看护培养法、平板培养法和微室悬滴培养法。花粉培养与花药培养的最大区别在于，它是将花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。因此花粉培养具有下列优点：①可避免花药培养过程中因存在有害物质出现阻遏小孢子启动第１次分裂的问题，使小孢子胚胎及其再生植株的产量远高于花药培养；②无论是经愈伤组织或胚状体，最终获得的小植株均为单倍体或双单倍体，从遗传学上而言均是纯合植株；③小孢子培养可观察由单细胞到雄核发育的全过程，诱变处理时，花粉能均匀地接触化学和物理诱变剂，可揭示花粉吸收、转化和诱变机制，因此它可作为遗传与发育及诱变机制研究的理想材料。9.4.2.3离体雌核发育雌核发育（gynogenesis）是植物存在的自然现象，在离体条件下可以通过培养未受精的子房和胚珠产生单倍体植株，也可以在活体条件下通过授以不同种类的花粉或通过物理方法处理（如辐照处理）的花粉诱导雌核发育，目前已在小麦、水稻、玉米、甜菜、向日葵、马铃薯、西葫芦、洋葱、黄瓜、非洲菊、百合、小黑杨、三叶橡胶、烟草、矮牵牛等１０多种植物上获得成功。影响雌配子体诱导产生单倍体的影响因素有供体植物的基因型、供体植物的生长环境、预处理、培养基等。离体条件下诱导孤雌生殖获得加倍单倍体的技术发展时间不长，现已开始应用于作物的改良、构建遗传分析和转基因的受体材料。9.4.3原生质体培养和体细胞融合（杂交）技术植物原生质体是被去掉细胞壁的具有生活力的裸细胞。由于原生质体比完整的细胞更容易摄取外来遗传物质、细胞器以及细菌和病毒等微生物，为研究高等植物遗传转化问题提供了较好的试验材料。同时，原生质体在一定条件下可以诱导融合形成杂种细胞并分化形成植株，为育种开拓了一条新途径，从而引起了人们的广泛重视。原生质体培养和体细胞杂交的步骤如下。（１）原生质体的分离要进行原生质体培养及体细胞杂交，首先要获得大量有活力的原生质体。已经从多种材料中成功地游离出原生质体，如叶、花瓣、果肉、茎髓部、子叶、下胚轴、幼小的根、茎、叶、愈伤组织和悬浮细胞等，不同材料常具有某些不同特点，用得最普遍的是叶肉细胞、愈伤组织和悬浮细胞。通常高等植物细胞壁的主要成分是纤维素，但也含有少量半纤维素、果胶质和蛋白质。不同植物细胞类型或不同生长发育时期其细胞壁的组成和结构也不相同。要去掉细胞壁获得有生活力的原生质体通常用一步酶解法，即把一定量的用于酶解细胞壁的酶类（果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶和蜗牛酶等）组成混合酶溶液，材料放入其中处理即可分离得到原生质体。研究表明，原生质体的产量和质量受组织和细胞的生理状态、酶的种类、溶液的组成成分以及渗透稳定剂（Ｃａ２＋）的类型和浓度等的影响。在分离原生质体的过程中常有很多残余物，应进行纯化，方法有离心沉淀法、飘浮法、滴洗法等。得到的原生质体应用形态、活性染色、荧光染料染色等方法测定活力。（２）原生质体的培养培养原生质体的基本营养同一般组培，但对某些组分，如钙和碳源的水平要求更为严格。由于原生质体没有细胞壁，在培养基中保持一定的渗透压极为重要，故采用适当的培养基是获得培养成功的关键之一。常用的原生质体培养基有ＭＳ培养基、Ｂ５培养基等。多数植物的原生质体适宜培养后１～３天再生新细胞壁，表现在原生质体体积稍有增加、膨大，继而由圆形变为卵圆形，这是新壁形成的特征。在胞壁形成的同时，胞质增加，液泡减少或消失，叶绿体或颗粒内含物可分散在胞质中也可围绕在细胞核的周围，并开始出现分裂，多数能进行持续分裂。许多植物的分裂结果是形成愈伤组织，有的形成胚状体然后长成植株，有的先形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成胚状体，经进一步的培养和处理可发育成为完整植株。（３）体细胞杂交以体细胞原生质体为亲本进行融合的一种细胞工程技术，是建立在植物组织、细胞培养和原生质体培养的基础上。主要包括以下３个环节：①原生质体融合主要有ＰＥＧ法、电融合法、高钙高ｐＨ法、ＮａＮＯ３法等；②杂种细胞筛选目前主要采用突变细胞遗传互补选择法、营养互补选择法和根据原生质体特性差异的机械选择法；③体细胞杂种植株鉴定主要方法有形态学方法、细胞学（染色体）方法、同工酶法、分子标记法、荧光原位杂交技术等。原生质体培养和体细胞杂交是植物细胞工程的核心技术之一，为克服植物远缘杂交不亲和性、创造新的种质资源、实现植物遗传转化和进行细胞学基础研究提供了重要的技术支撑。目前，获得的原生质体再生植株包括粮食作物、蔬菜、果树、花卉、林木、药用植物以及真菌和海藻等。利用体细胞融合技术可以克服有性杂交不亲和性，创造新的物种或类型，实现植物种间、属间，甚至科间的体细胞杂交，如番茄＋马铃薯、甘薯栽培种＋野生种、甘蓝＋白菜、拟南芥＋甘蓝型油菜、酸橙＋甜橙、红橘＋枳壳的杂种培育等。利用细胞融合技术还获得了一些特异的新种质，如细胞质雄性不育水稻、细胞质雄性不育烟草等。尽管目前已在多种植物上建立了体细胞杂交和遗传操作的技术程序，但还有相当多的植物在原生质体培养上存在技术困难，仍需进一步加强多学科的交叉研究以及技术集成和创新。9.4.4体细胞突变体筛选技术随着国内、外学者应用组织培养技术筛选突变体取得一些成果，组织培养逐渐成为遗传变异的一个重要来源。近年来，除了利用愈伤组织继代过程中产生的自发突变以外，还采用射线、甲基磺酸乙酯等物理或化学因素诱发变异，并在细胞水平上进行抗性突变体的筛选，可以大大减少植物改良所需投入的人力、物力。与常规育种方法相比，离体筛选具有以下优点：①可以获得广泛的变异类型，甚至产生自然界尚未发现的突变，为抗病选择提供遗传基础；②可以在较小空间内培养和处理大量细胞；③在细胞水平上直接诱发和筛选突变体，是高等植物抗性育种微生物化的一种尝试，易于从单倍体细胞选出隐性突变，经加倍成为二倍体或双倍体，较快地得到纯合稳定的抗病材料；④在人工控制条件下体外定向选择，易于进行同位素示踪、半微量分析等试验，不受地区和季节限制；⑤可以从细胞、组织及整株水平上进行生化、遗传和抗病机制的研究。（１）突变细胞的筛选方法常用的有直接选择法和间接选择法。直接选择法是指新的突变表型在选择条件下能优先生长，或预期在感观上可测定其他可见的差异。直接选择法分为正选择和负选择两种类型。正选择是用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基中正常型的细胞不能生长，只有突变体才能生长，借此可以分离出突变体细胞。如果加入培养基中的选择剂的剂量较高，可以一次性地有效抑制或杀死所需突变体以外的其他细胞，使突变体保留下来，这种选择方式称为一步选择系统。但若开始加入培养基的选择剂剂量较低，在较长时间内只有少量的细胞生长，９０％的细胞不能生长，从中选择生长较好的细胞，然后依次增加选择剂的浓度，进行第２轮、第３轮的筛选，最后得到抗性的细胞，这种选择方式称为多步选择系统。一步选择系统得到的突变体较多是单基因突变。多步选择系统的生化背景不详，获得的突变体可能是多基因变化的突变体，这种突变体较为有效。负选择是用特定的培养基使突变体细胞处于不能生长的状态，而正常型的非突变细胞则可以生长，然后用一种能使生长中的细胞中毒死亡的汰选剂淘汰这些细胞，最后使未中毒的突变细胞恢复生长并分离出来。负选择法常用于分离营养缺陷型突变细胞。间接选择法是借助与突变表型有某种相关的特征作为间接选择指标的选择方法。如在离体培养细胞中直接选择抗旱性是困难的，可通过选择抗羟脯氨酸类似物的突变体，从而间接筛选抗旱突变体。此外，突变体还可利用ＲＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＳＳＲ、ＳＣＡＲ等分子标记技术（详见9.5节内容）进行选择。（２）突变性状的遗传基础及其稳定性鉴定利用选择培养基开展突变体选择时，能够在选择培养基上生长的细胞并非均为突变细胞。一部分细胞有可能由于没充分与选择剂相接触而残留下来，还有可能经过选择后获得的是非遗传的变异细胞。鉴别经选择出来的细胞是否性状稳定时，常用的方法是让细胞或组织在没有选择剂的培养基上继代培养，如果仍能表现选择出来的变异性状，便可确认为是突变细胞或组织。鉴别从变异细胞或组织再分化形成的植株是否为突变植株时，可用所形成的植株开花结实后的发芽种子或者用种子长成的植株为材料，诱导其形成愈伤组织，再转移到含有选择剂的培养基上进行检验。如果所选择的突变性状是可以在植株个体水平表达的性状时，如抗病性等，也可以用再生植株本身进行鉴定。细胞突变的诱发以及细胞突变体的筛选标志着诱变育种已向细胞水平进展。目前，利用培养细胞与组织进行离体筛选的研究主要集中在营养缺陷型、抗病、抗盐、抗除草剂、抗温度胁迫、抗水分胁迫等突变体的筛选方面。通过突变体的离体筛选已得到抗黑根病的甘蓝、抗青枯病和萎蔫病的番茄、抗枯萎病的芹菜、抗根腐病的莴苣、抗萎蔫病的马铃薯、抗枯萎病的菜豆、耐盐的杨树、耐碱的毛白杜鹃、抗溃疡病的欧洲落叶松等。但由于这一技术历史较短，在应用上受到组织培养技术、分离筛选突变体的方法和水平，以及变异表型能否稳定等多方面的限制。只有在搞清细胞变异体表型发生变化的原因、性质及其遗传传递规律的基础上，细胞突变体的筛选及其利用才能发挥更大的作用。9.4.5植物快繁技术植物快繁技术应用于高附加值经济植物、珍稀濒危植物、转基因植物、育种原种以及植物脱毒苗的快繁，是植物细胞工程中应用最为广泛的技术，取得了显著的经济效益。利用超低温保存种质法结合快繁技术可以实现植物种质资源的中长期保存和利用；通过茎尖培养或利用组织培养技术并结合物理、化学方法获得无毒苗，成为植物细胞工程技术的重要方面。我国开展植物快繁技术研究较早，于２０世纪７０年代中期开始规模化植物快繁脱毒的研究和应用，植物种类包括果树、蔬菜、花卉、林木、药用植物等，其中以脱毒马铃薯、兰花、甘蔗、香蕉、葡萄、草莓、苹果、柑橘、杨树等规模较大。植物快繁生物反应器的出现为植物快繁技术带来根本性变革，成为快繁技术发展的新方向。植物快繁生物反应器具有生产规模大、便于自动化控制、显著降低玻璃化苗的比例、降低成本和污染以及节约人力资源等特点，目前已在木薯、马铃薯、咖啡、橡胶、菠萝、甘蔗、香蕉、苹果、梨等植物上获得成功。利用生物反应器生产大量繁殖体和制作人工种子，可实现人工种子生产的规模化，为植物快繁、杂种优势利用和种业发展带来革命性的变化。9.5分子标记辅助育种生物技术的发展给植物遗传育种研究提供了新的手段，分子标记作为一种基本的遗传分析手段，是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记（geneticmarker）。遗传标记是指可以稳定遗传的、易于识别的、特殊的遗传多态性形式。9.5.1分子标记及其种类自20世纪80年代初发展起来的分子标记技术是通过遗传物质ＤＮＡ序列的差异来进行标记，具有以下优点：①直接以ＤＮＡ的形式表现，在植物的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的影响，不存在表达与否的问题；②数量极多，遍及整个基因组；③多态性高，自然存在许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；④不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁遗传现象；⑤许多分子标记能够鉴别纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。由于分子标记具有较大的优越性，其应用越来越广泛。从发展进程上可将其分成３个世代：第１代是以传统的Southern杂交为基础的分子标记，如限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）；第２代是以ＰＣＲ为基础的分子标记，如随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、简单序列重复或微卫星（ＳＳＲ）、扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）、特异序列扩增区域（ＳＣＡＲ）、酶切扩增多态性序列（ＣＡＰｓ，又称ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）、序列标签位点（ＳＴＳ）等；第３代是以基因组序列为基础的分子标记，如单核苷酸多态性（ＳＮＰ）、插入或删除（insertdelete）、编码简单序列（codingsimolesequencerepeat）及表达序列标签（ＥＳＴ）等。（１）ＲＦＬＰ标记基本原理是由于酶识别序列内的点突变或部分ＤＮＡ片段的缺失、插入、倒位和易位而引起酶切位点的缺失或获得，导致限制性位点改变，再利用限制性内切酶切割ＤＮＡ时，就产生了大量的多态性片段。该标记具有共显性特点，可以区别纯合基因型与杂合基因型，能够提供单个位点上较完整的资料。结果稳定可靠、重复性好，特别适合于连锁图谱的建立。（２）ＲＡＰＤ标记以一个随机的寡核苷酸序列（通常为１０个碱基）为引物，通过ＰＣＲ对基因组ＤＮＡ进行随机扩增，产生大小不同的ＤＮＡ片段，再经凝胶电泳分开，进行多态性观察。与ＲＦＬＰ相比，ＲＡＰＤ方法简单、快速，灵敏度高，ＤＮＡ用量少，而且不需要用同位素标记，安全性好。但是由于ＲＡＰＤ的重复性差，稳定性不好，不能区分杂合基因型与纯合基因型，所以限制了它的利用。（３）ＳＳＲ标记基因组中存在的由２～５个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。这种序列广泛分布于真核生物基因组，其重复次数的不同就产生了等位基因之间的多态性。由于ＳＳＲ两端多为相对保守的单拷贝序列，通过设计引物便可以进行ＰＣＲ扩增，进行多态性检测。（４）ＡＦＬＰ标记通过对基因组ＤＮＡ酶切片段的选择性扩增来检测ＤＮＡ酶切片段长度的多态性。ＡＦＬＰ揭示的ＤＮＡ多态性是酶切位点及其后的选择性碱基的变异，ＡＦＬＰ扩增片段的谱带数取决于采用的内切酶和引物３′端选择碱基的种类、数目及所研究的基因组的复杂性。由于ＡＦＬＰ是限制性酶切与ＰＣＲ结合的一种技术，因此具有ＲＦＬＰ技术的可靠性和ＰＣＲ技术的高效性，可以在一个反应内检测大量限制性片段，一次可获得５０～１００条谱带的信息，可为不同来源以及不同复杂程度基因组的分析提供一个有力的工具。（５）ＳＴＳ标记一种将ＲＦＬＰ标记转化为ＰＣＲ标记的方法。它通过ＲＦＬＰ标记或探针进行ＤＮＡ序列分析，然后设计出长度为20ｂｐ左右的引物，对基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增寻找多态性。它的扩增产物是一段长几百碱基对的特异序列，此序列在基因组中往往只出现１次，因此能够界定基因组的特异位点。ＳＴＳ标记的信息量大、多态性好，是共显性标记，能够鉴定不同的基因型。（６）ＳＣＡＲ标记在ＲＡＰＤ技术上发展起来的一种分子标记。其方法是将目标ＲＡＰＤ标记克隆并进行末端测序，根据原ＲＡＰＤ片段两端的序列设计特定引物（通常为24ｂｐ），对基因组ＤＮＡ再进行ＰＣＲ扩增分析。ＳＣＡＲ标记是共显性遗传，与ＲＡＰＤ标记相比有更好的稳定性、更高的可重复性。（７）ＣＡＰｓ标记又称为ＰＣＲ－ＲＦＬＰ。所用的ＰＣＲ引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是先进行ＰＣＲ扩增，扩增产物用限制性内切酶酶切，电泳分析多态性。与ＲＦＬＰ技术一样，ＣＡＰｓ技术检测的多态性是酶切片段大小的差异。（８）ＳＮＰ标记用于测定同一物种不同个体间染色体上遗传密码单个碱基的变化，是继ＲＦＬＰ和ＳＳＲ之后一种新的分子标记。它是对某特定区域的核苷酸序列进行测定，将其与相关基因组中对应区域的核苷酸序列比较，检测出单个核苷酸的差异，这个有差异的ＤＮＡ区域被称为ＳＮＰ标记。ＳＮＰ标记在大多数基因组中存在较高的频率，数量丰富，可进行自动化检测。（９）EST标记长度为150～500ｂｐ的基因表达序列片段。EST技术是将ｍRNA反转录成ｃDNA，并克隆到质粒或噬菌体载体构建成ｃDNA文库后，大规模随机挑选ｃDNA克隆，对其５′或３′端进行一步法测序，所获序列与基因数据库中已知序列进行比较，从而获得对生物体生长、发育、代谢、繁殖、衰老、死亡等一系列生理、生化过程认知的技术。以EST为基础的分子标记具有开发简便、信息量高和通用性好等特点。根据开发的方法不同，ＥＳＴ标记可分为以下４类：①EST-SSR和EST

-PCR（微卫星）标记以ＰＣＲ技术为核心，操作简便、经济，是目前研究和应用最多的一类；②EST-SNP（单核苷酸多态性）标记以特定EST区段内单个核苷酸差异为基础的标记，可依托杂交、PCR等多种手段进行检测；③EST-ＡＦＬＰ标记以限制性内切酶技术和PCR相结合为基础的标记；④EST-ＲＦＬＰ标记以限制性内切酶和分子杂交为依托，以EST本身作为探针，与经过不同限制性内切酶消化后的基因组ＤＮＡ杂交而产生的。9.5.2分子标记在育种中的应用分子标记可广泛应用于育种研究。下面就目前分子标记在园艺植物育种中的主要应用内容介绍如下。9.5.2.1分析亲缘关系和植物的起源演化问题分子标记所检测的是植物基因组ＤＮＡ水平的差异，具有稳定客观的特点，且引物多，借助分子遗传图谱对品种之间的比较可覆盖整个基因组，从而可为物种、变种、品种和亲缘类群间的系统发育关系提供大量的ＤＮＡ分子水平的证据；为种质资源的鉴定与保存、探究物种的起源与进化、远缘杂交亲本的选配、预测杂种优势等提供理论依据。自从1980年Bostein和White等首次提出用ＲＦＬＰ作为遗传标记构建遗传连锁图谱以来，遗传作图得到飞速发展。目前，已构建番茄、黄瓜、白菜、西瓜、胡萝卜、苹果、葡萄、樱桃、杨树、松树、桉树、云杉、红豆杉、柳杉、花旗松等多种园艺植物的分子遗传图谱。分子遗传图谱构建为园艺植物品种资源的研究、育种中亲本材料的选择和选配以及育种方案的制定提供了依据，也为物理图谱的构建、基因定位和克隆等奠定了基础。9.5.2.2构建遗传图谱园艺植物性状可区分为质量性状和数量性状，因此在开展其基因定位过程中应区别处理。目前，质量基因的定位方法主要有两种：①利用近等基因系或分离群体分组分析法（bulkedsegregateanalysis,BSA），BSA是将Ｆ2分离群体中研究的目标性状，根据其表型（如抗病和感病）分成两组，将每组内一定数量植株的DNA混合，形成按表型区分的DNA池，也称近等基因池（isogenicDNApool），待用作模板进行RAPD分析；②利用已有的连锁图进行标记，一旦发现某一目标基因被定位在某一染色体上，就可以选择分散在染色体不同位点的标记逐渐逼近，找到该基因的分子标记。这些与目标基因紧密连锁的分子标记的发现，使进一步克隆目标基因、进行基因转移成为可能。如莴苣抗霜霉病基因的定位就是通过BSA法实现的。对于尚无连锁图或连锁饱和程度较低的植物，BSA法可为获得与目标性状连锁的分子标记提供快速有效的途径，可通过基于性状表型的BSA法和基于标记基因型的BSA法来实现。9.5.2.3基因定位而对于数量性状的基因定位，可通过数量性状基因座（quantitativetraitloci,QTL）作图来完成，其实质就是通过确定数量性状位点与分子标记间的连锁关系实现QTL作图。用于QTL作图的群体最好是永久性群体，如重组近交系和加倍单倍体群体。开始时，分离群体用单标记分析方法进行QTL的定位。例如，在一个Ｆ2群体中，给予任何一个特定的标记Ｍ，若所有Ｍ１Ｍ１同质个体的表型平均值高于Ｍ２Ｍ２同质个体，那么就可以推荐存在一个QTL与这个标记连锁。如果显著水平设置太低，这种方法的假阳性高。应用分子标记通过与目的基因相连锁的标记物（如ＤＮＡ片段）的间接选择来选择所期望的基因型。这种间接选择具有许多优点：①通过分子标记可以进行早期选择，把不具备所期望性状基因型的个体淘汰掉，这样既可节省开支，又可加快育种进度；②可区别较细微的差异，有些性状，如多位点控制的数量性状，个体间差异并不明显，造成直接选择的困难；

9.5.2.4分子标记辅助选择③不需要对育种材料进行接种试验，可同时对几个性状进行选择，而用传统的方法对几个表现时期不同的性状很难同时进行直接选择。例如在回交育种过程中，随着有利基因的导入，与有利基因连锁的不利基因（或染色体片段）也会随之导入，成为连锁累赘。利用与目的基因紧密连锁的ＤＮＡ标记，可以选择在目的基因附近发生重组的个体，显著减少连锁累赘，提高选择的效率。利用分子标记辅助选择，首先要将目的基因进行精细定位。在不同的群体中，标记之间的遗传距离会有所变化，所以要在所研究的材料中根据已发表的资料重新对基因进行定位。目的基因和标记的遗传距离应不大于10ｃＭ，然后以标记的基因辅助选择。近年来，应用分子标记建立品种的指纹图谱已用于品种纯度的鉴定，该方法在幼苗或种子阶段就可鉴定出品种纯度。品种纯度的鉴定可以消除同物异名、同名异物的现象，确定保护种质资源遗传完整性的最小繁种群体和最小保种量，进行核心种质筛选和种质资源的分类等。9.5.2.5种质资源及品种鉴定此外，利用相同分子标记进行不同物种间ＱＴＬ的比较作图，也已在茄科（番茄、马铃薯、辣椒等）和十字花科（拟南芥菜、甘蓝、花椰菜、油菜等）等的物种之间进行，并从中发现了物种间标记图谱与ＱＴＬ图谱的相似性，即发现了不同物种的共线性（不同物种中一致的基因位置和排序现象），由此可预测一些重要ＱＴＬ在不同物种中的位置，从已知物种基因来推知另一物种的同源基因的位置和功能，通过ＱＴＬ图谱的比较追溯物种的进化过程，并开拓新种质资源。这对于作物的重要农艺性状基因克隆和分子标记育种极为有利。随着生物技术领域中的植物基因组学（genomics，指对基因组作图、测序及分析的学科，主要涉及结构基因组学、功能基因组学和比较基因组学）和生物信息学（bioinformatics,涉及生物信息的获取、处理、储存、分发、分析和解释等所有方面，以阐明和理解大量数据所包含的生物学意义为目标的一门学科）的兴起，生物技术在园艺植物育种领域的应用前景将更广阔，它对推动园艺植物育种事业发展的作用将会更大。练习与思考１．什么是生物技术？２．遗传信息是怎样在生物上、下代之间传递的？３．基因工程在园艺植物育种中的应用主要体现在哪些方面？４．你对转基因植物的生物安全性是怎样理解的？５．细胞工程主要涉及哪些内容？６．怎样开展突变细胞的筛选？７．请简述体细胞杂交的步骤。８．请分析花药培养与花粉（小孢子）培养的异同。９．请分析分子标记的主要应用。本章小结THANKS园艺植物遗传育种第一章

绪论第二章经典遗传与细胞质遗传第三章数量遗传第四章园艺植物种质资源与引种驯化第五章选择育种第六章有性杂交育种第七章杂种优势利用第八章诱变育种第九章现代生物技术育种第十章新品种的审定与推广繁育实训1-15第十章新品种的审定与推广繁育10.1品种审定10.1.1品种审定的概念10.1.2品种审定的意义10.1.3品种审定制度10.2植物新品种保护

10.2.1植物新品种保护的意义10.2.2植物新品种保护的国际和国内现状10.2.3我国植物新品种保护条例的主要内容10.2.4植物新品种保护与品种审定的关系10.2.5观赏植物品种的国际登录10.3良种繁育与品种推广

10.3.1良种繁育的概念与任务10.3.2品种的混杂、退化及对策10.3.3良种繁育的程序和方法10.3.4品种推广

练习与思考

本章小结知识目标●了解品种审定的概念、意义和制度，新品种保护的意义、国际国内现状、我国植物新品种保护条例的主要内容●理解品种审定与新品种保护的关系、观赏植物品种的国际登录●了解良种繁育的概念和任务、良种繁育程序、品种推广的准则与方式方法●理解良种混杂、退化的现象及原因●掌握防止良种混杂、退化的对策，加速良种繁育的方法能力目标●能解释品种审定的概念、良种繁育的概念●针对客观情况能采取有效措施防止良种混杂、退化问题10.1品种审定根据2000年12月１日我国开始实施的枟中华人民共和国种子法枠第三章第十五条和第十六条的规定：“主要农作物品种和主要林木品种在推广应用前应当通过国家级或者省级审定，申请者可以直接申请省级审定或者国家级审定。由省、自治区、直辖市人民政府农业、林业行政主管部门确定的主要农作物品种和主要林木品种实行省级审定。”“通过国家级审定的主要农作物品种和主要林木良种由国务院农业、林业行政主管部门公告，可以在全国适宜的生态区域推广。通过省级审定的主要农作物品种和主要林木良种由省、自治区、直辖市人民政府农业、林业行政主管部门公告，可以在本行政区域内适宜的生态区域推广；相邻省、自治区、直辖市属于同一适宜生态区的地域，经所在省、自治区、直辖市人民政府农业、林业行政主管部门同意后可以引种。”可见，品种须经审定合格并公布后，才可正式繁殖推广。

园艺作物属于非主要农作物，其品种管理一般由各省级种子管理部门制定管理办法进行管理。目前，农业部确定了７种农作物，国家林业局确定了２００多个树种，必须通过国家级或省级审定。除了强制要求通过审定的农作物品种或林木品种外，其他农作物或林木品种均属于非强制性审定要求，申请人既可申