干细胞的体外培养技术原理及基本过程职业教育医学生物技术专业

职业教育医学生物技术专业教学资源库干细胞的体外培养——技术原理及基本过程职业教育医学生物技术专业教学资源库一、技术原理职业教育医学生物技术专业教学资源库（一）技术原理基本原则：促进ES增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态。有饲养层（feederlayer）培养法：以小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系（STO）或小鼠胚胎成纤维细胞（MouseEmbryoFirbroblasts,MEF）制备饲养细胞单层，主要是利用其分泌的生长因子FGF和抑制干细胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干细胞在体外克隆而不分化。无饲养层培养法：利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基或在基础培养基中加入重组的LIF制备条件培养基。职业教育医学生物技术专业教学资源库二、基本过程职业教育医学生物技术专业教学资源库饲养层细胞制备或条件培养基制备胚胎的制备和培养胚胎干细胞的分离胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的鉴定冻存与复苏细胞克隆形态碱性磷酸酶检测核型的鉴定分化能力的观察嵌合能力的测定职业教育医学生物技术专业教学资源库1、饲养层细胞培养小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）：取孕12.5-14.5d鼠胚胎躯干，以植块培养法或分散细胞培养法制备，取第三代至第五代细胞作为饲养层细胞。STO细胞：按照一般已建细胞系培养方法。DMEM加10%小牛血清作为培养液。采用胎数多小鼠一次大量培养MEF冻存，用时复苏。职业教育医学生物技术专业教学资源库MEF和STO的优缺点：MEF分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制分化因子的能力比STO强，STO作饲养细胞时常需在培养基中加入LIF。MEF不能长期传代，需经常准备怀孕小鼠制备第三代至第五代细胞，STO则可长期传代培养。MEF不具耐药性，不能作为转染外源性基因的胚胎干细胞筛选用。SNL细胞为转染了neor抗性基因和LIF基因的STO细胞，可分泌足够的抑制分化因子，并因带有neor抗性基因可用于转基因胚胎干细胞筛选。职业教育医学生物技术专业教学资源库胚胎干细胞培养过程中，死亡MEF或STO的染色体可能导致胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。不易获得纯的胚胎干细胞作为生化和分子生物学方面的分析。使用前如用丝裂霉素C处理，如清洗不彻底，残余的丝裂霉素C会影响胚胎干细胞的增殖。职业教育医学生物技术专业教学资源库2、饲养单层制备MEF或STO连成一片，以含10μg/ml丝裂霉素培养液370C作用2-3h（如细胞层较薄，也可缩短至30min-1.5h），或γ射线照射（剂量为30-100Gy）。弃含丝裂霉素培养液，PBS洗5次，γ射线处理者不用清洗。消化细胞，制备悬液种植至用0.1%明胶处理过（0.1%明胶水溶液覆盖培养瓶表面，室温2h以上）的培养瓶，种植细胞数：MEF7.5×104-105个/cm2，STO为5×104个/cm2。培养至细胞连成一片没有间隙（中间可补加处理过的细胞），制备好的饲养单层置培养箱，5天内使用，使用前换成干细胞培养液。职业教育医学生物技术专业教学资源库观察：好的饲养单层，细胞连成一片，无间隙，死亡细胞和杂细胞极少。MEF和STO产生的抑制分化因子一部分分泌到培养液中，一部分锚定在细胞外基质上。无间隙的饲养单层保证了胚胎干细胞都能与饲养层细胞接触而达到最佳效果。职业教育医学生物技术专业教学资源库3、用于培养胚胎干细胞的条件培养基直接在胚胎干细胞培养液中加入重组的LIF，使终浓度为1000U/ml。Baffalo大鼠肝细胞株BRL条件培养基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干细胞分化的因子DIF。收集培养72h的培养液，过滤除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干细胞培养液，再添加8-10%胎牛血清。年龄2-3周大鼠心肌细胞条件培养基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干细胞分化因子。收集1-6代细胞培养液，过滤除菌，用前6份+3份胚胎干细胞培养液+1份胎牛血清。职业教育医学生物技术专业教学资源库4、胚胎干细胞的分离和培养（1）培养液配制培养液要用超纯水或五蒸水，不能有细菌内毒素污染，水要现用现制。高糖DMEM作为基础培养基，葡萄糖浓度为（4.5g/L）：有助于囊胚贴壁、内细胞团增殖及胚胎干细胞集落形成。使用前还要添加β-巯基乙醇（0.1mmol/L）或单硫甘油（0.15mmol/L）：保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进胚胎干细胞的贴壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺点。职业教育医学生物技术专业教学资源库血清缺点：成分复杂，不利于整合到胚胎干细胞基因组中外源性基因功能的测定；可能含有一些未知的促进胚胎干细胞分化的因子；含有微量的血红蛋白和内毒素，干扰胚胎干细胞生长。无血清胚胎干细胞培养液无上述缺点，但细胞贴附力不如有血清培养基。职业教育医学生物技术专业教学资源库（2）胚胎干细胞的分离小鼠：母小鼠超数排卵交配（注射孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培养：培养皿内制备直径0.5cm左右露滴状培养液液滴，并覆盖透明石蜡油，胚胎置于液滴中培养胚胎干细胞分离：普通分离法、免疫外科法，弃除滋胚层细胞，获得内细胞团（innercellmass，ICM），并分散为3-4个细胞在一起的细胞团职业教育医学生物技术专业教学资源库（3）胚胎干细胞培养有饲养层细胞培养：将内细胞团吸置处理过的饲养层上，一个内细胞团放置一个孔，370C、5%CO2、饱和湿度培养2d后出现小集落，并逐步增大，6-10d可消化传代，消化时，消化30s后弃消化液，残余消化液继续作用，当饲养单层出现裂隙（或显微镜下细胞之间分开），终止消化，一般为2-3min加适量培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种新饲养层扩大培养。无饲养层培养：明胶包被培养板，条件培养基。已建系胚胎干细胞：将已培养2-3d生长旺盛干细胞消化成单细胞悬液，添加新的培养液，按照1：3或1：6比例转钟。职业教育医学生物技术专业教学资源库注意事项：最初分离的内细胞团以3-4个细胞团为宜，但集落形成后，传代过程中一定要消化成单细胞，否则胚胎干细胞会互相诱导，易于分化。培养条件要始终如一。为了增强胚胎干细胞粘附力，除明胶包被外，还可以用纤维连接蛋白和多聚赖氨酸等促进粘附。职业教育医学生物技术专业教学资源库（4）培养结果hES细胞集落（×10）胚胎干细胞呈集落状（岛屿状）生长，边缘整齐，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清。消化成单细胞后细胞小而圆，核大，胞浆小。职业教育医学生物技术专业教学资源库小鼠胚胎生殖细胞的相位衬度图像职业教育医学生物技术专业教学资源库小鼠胚胎生殖细胞培养皿含有数百个小鼠胚胎生殖细胞群的培养皿。每一个红色染色的斑点代表一个由数百或数千个干细胞组成