（高清版）DB51∕T 1077-2010 饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 高效液相色谱法　　

DB51/T1077—2010饲料中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的测定高效液相色谱法I前言 1范围 12规范性引用文件 13原理 14试剂和溶液 1 1 27分析步骤 28结果计算 29精密度 3附录A(资料性附录) 4Ⅱ本标准的附录A为资料性附录。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准由四川省饲料工作总站负责起草。本标准起草人：柏凡、张静、李云、冯娅、甄阳光、赵立军。1饲料中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的测定高效液相色谱法本标准规定了测饲料中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的含量的高效液相色谱法(HPLC)。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料及饲料原料的测定。本标准中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的检出限分别为2.0μg/kg、0.8μg/kg、2.5μg/kg、1.5μg/kg。2规范性引用文件凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备试样经乙腈-水提取，离心、过滤后，取滤液经过免疫亲和柱净化，浓缩，用高效液相色谱仪-柱后衍生-荧光检测器检测，外标法计算黄曲霉毒素B₁、B₂、Gi、G₂含量。4试剂和溶液除特殊说明外，所有试剂均为分析纯，色谱用水符合GB/T6682一级用水的规定。4.1甲醇：分析纯、色谱纯。4.4磷酸氢二钠。4.6甲醇-水(70+30)提取液：量取甲醇700mL,加水300mL,混匀。4.7磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g氯化钠、1.44g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，溶于1000mL水，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH7.4。4.8.1标准贮备液：精密量取1.0mL黄曲霉毒素混合标准溶液，用乙腈溶解、定容至10mL,此贮备液黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂浓度分别为200μg/L、50μg/L、200μg/L、50μg/L,置于冰箱中2℃~8℃保存，有效期6个月。4.8.2标准工作溶液：分别准确移取标准贮备液，用流动相配制成标准工作溶液，黄曲霉毒素B₁、G₁的浓度为1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L,黄曲霉毒素B₂、G₂的浓度为0.25μg/L、0.50μg/L、1.25μg/L、2.50μg/L、5.00μg/L、12.50μg/L,置于冰箱中2℃~8℃保存，有效期1个月。4.9黄曲霉毒素免疫亲和柱。5仪器与设备25.1分析天平：感量0.1mg。5.2振荡器。5.3离心机：转速为5000r/min以上。5.4超纯水处理器。5.5涡旋混合器。5.6高效液相色谱仪：配备荧光检测器。5.7柱后光化学衍生器。5.8氮吹仪。5.90.45μm滤膜。6试样制备按GB/T14699.1规定采集试样后，按GB/T20195规定，选取具有代表性的实验室样品1kg,四分法缩减分取200g左右，粉碎过1mm孔筛，混匀装入磨口瓶中备用。7分析步骤7.1试样溶液的制备7.1.1提取称取25g试样(精确至0.01g)于锥形瓶中，加入125mL甲醇-水(70+30)提取液(4.6),振荡提取40min,离心，取上清液过滤，准确量取滤液10mL,加入30mLPBS(4.7)稀释，混匀，待净化。7.1.2净化取10mLPBS活化小柱，将上述10mL提取液以1-2滴/秒的速度通过免疫亲和柱，用10mLPBS(4.7)水淋洗，抽干柱子，用1mL甲醇(4.1)洗脱。洗脱液60℃氮气吹干，准确加入流动相(7.2.3)1.0mL,涡旋30s,过0.45μm滤膜，上机测定。7.2色谱条件7.2.1色谱柱：C₁8柱，柱长250mm,内径4.6mm,粒度5μm;或性能相当的色谱柱。7.2.2柱温：30℃。7.2.3。7.2.5检测器：荧光检测器，Ex:370nm,Em:450nm。按上述色谱条件，分别将标准溶液和试样溶液上级测定，按照保留时间进行定性，单点或多点校正外标法定量。8结果计算试样中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的含量X,以质量分数微克每千克(μg/kg)表示，单点校正按式(1)计算：式中：V——上机定容体积，单位为毫升(mL);As——黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂标准溶液对应的色谱峰面积；A——试样溶液对应的色谱峰面积；Cs——黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂标准工作溶液的浓度，单位为微克每升(μg/L);3m——试样质量，单位为克(g);n——稀释倍数。结果用平行测定的算术平均值表示，保留