受体卵母细胞的准备超数排卵周龄的昆明白小鼠雌性

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法1.受体卵母细胞的准备

（1）超数排卵

4周龄的昆明白小鼠，雌性，10IU的注射用孕马血清促性腺激素（PMSG）腹腔给药，48h后腹腔注射10IU的注射用绒毛膜促性腺激素（HCG）。职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法昆明白小鼠

孕马血清促性腺激素（PMSG）

绒促性素（HCG）职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法（2）取卵

15h后，小鼠吸入二氧化碳颈椎脱臼安乐死。将安乐死后的小鼠腹部向上平躺，70％医用酒精喷洒于小鼠腹部消毒，尽量减少污染。使用眼科镊夹起小鼠腹部腹中线附近的皮毛，并尽量提起，眼科剪在腹腔中间部位剪一小口，眼科剪换成另一把眼科镊，两头同时用力向相反方向撕拉小鼠皮肤，使腹腔完全暴露。职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法（2）取卵

用眼科剪和眼科镊打开腹腔壁，在肾的附近用镊子夹住子宫角的上部，将脂肪垫、子宫、输卵管、卵巢一起拉出腹腔。眼科镊夹住卵巢轻轻提起，眼科剪在靠近输卵管的子宫系膜上开一口，将子宫、输卵管及卵巢与子宫系膜分离。将卵巢与输卵管分离，输卵管下方子宫体1cm处剪断，剪下部分放入培养皿中（放有预热好的杜氏磷酸盐缓冲液D-PBS）。职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法（2）取卵

将输卵管和带着的部分子宫转移入另一放有预热好D-PBS的培养皿，在体视显微镜下用眼科镊固定两端，26号注射针头或者另一把眼科镊撕破输卵管壶腹部，释放出卵丘卵母细胞团。如细胞团不能自己释放，用镊子轻轻地把它们挤出壶腹部。职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法

倒置显微镜职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法

输卵管里的卵泡

卵丘细胞-卵母细胞

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法（2）取卵

将所有卵丘卵母细胞团用移液枪移入预热好的透明质酸酶中，用200μl的枪头来回吹打1~2min或者吹打80~100下，得到MⅡ卵母细胞。用吸卵针收集的卵母细胞和转移到KSOM培养液，洗三次以除去残留的透明质酸酶，卵丘细胞和杂质。然后将卵母细胞转移到平衡好的微滴培养皿中（微滴培养皿中的培养液需要在37℃、5%CO2培养箱中平衡至少4h以上），放入CO2培养箱中培养30min左右。职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法移液枪

微滴培养皿

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法2.供体细胞的准备（1）卵丘细胞制备1）收集卵细胞时，透明质酸酶消化后可以将卵丘细胞与卵细胞分离开。2）将卵细胞挑选出之后，将剩余的卵丘细胞用口吸管挑出来，用HCZB洗两遍。3）将卵丘细胞放入到带有HCZB的EP管中，1000rpm，4℃离心机离心5分钟。去除上清，用3%的PVP溶液重悬，放到冰上保存备用。离心管

（Eppendorf管）职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法2.供体细胞的准备：（2）HCZBH-CZB卵操作液配制：100mLCZB中加入0.4776gHepes和0.042gNaHC03及0.01gBSA。HEPES

一种非离子两性缓冲液,其在pH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力。BSA

牛血清白蛋白职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法2.供体细胞的准备：（2）HCZB职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法3.卵母细胞的去核与注射1）准备操作滴：用含５mg/mLCB的HCZB制作去核、注核操作滴，分别做3%PVP和10%PVP液滴作为洗针液，上层用矿物油覆盖，放于37℃温台上预热。

职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法3.卵母细胞的去核与注射２）选择透明带界限清晰、没有分裂碎片的卵细施，用口吸管放到操作滴中。３）先用持卵针固定住卵母细胞，调整卵细胞的位置，使纺锤体位于３点钟的位置，用去核针将纺锤体吸出。去核的卵细胞静置一段时间后转移到CZB培养基中保存备用。职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法3.卵母细胞的去核与注射

４）将前面准备好的卵丘细胞用口吸管转移到3%的PVP液滴中，挑选生长状况良好的细胞，用注核针将细胞反复的吸进和退出，使细胞核暴露出来，然后将细胞核注射到去核的卵细胞中，重组好的胚胎转移到CZB培养液中放置30分钟以上。职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法4.胚胎激活

准备活化滴：取出1mLCa2+free

CZB，先加入10uLGlutamine储液和５uLCB，然后加入10uLsrcl2储液，混匀后做滴。将做好的活化滴放到37℃，5%的CO2培养箱中平衡20分钟以上备用。职业教育医学生物技术专业教学资源库核移植技术具体方法4.胚胎激活

胚胎激活：将重组胚胎转移到活化液中，在37℃，5%的CO2培养箱中培养5小时。职业教育医学生物技术专业教学资源库（三）核移植技术具体方法5.重组胚的培养。

将活化后的重组胚胎转移到G1培养基中培养并观察，当胚胎发育到8-细胞时期的时候，将胚胎转移到G2培养基中培养，直至胚胎发育到囊胚时期。职业教育医学生物技术专业教学资源库（三）核移植技术具体方法6.胚胎移植（1）假孕母鼠的准备1）选取8-10周龄的母鼠，与结扎公鼠按照3:1或4:1的比例合笼。2）第二天上午检查母鼠的交配情况，将见栓的母鼠挑出，记为见栓0.5天。职业教育医学生物技术专业教学资源库（三）核移植技术具体方法6.胚胎移植（2）输卵管移植1）挑选见栓0.5天的假孕母鼠，腹腔注射麻醉剂。2）将麻醉的假孕母鼠背部向上放在手术台上，酒精消毒。用手术剪在小鼠的背腰中央小心地剪开皮肤和肌肉，开口不要过大。3）用镊子夹住脂肪组织，把一侧的部分子宫、输卵管、卵巢一起拉出，固定好后放到体视显微镜下。职业教育医学生物技术专业教学资源库（三）核移植技术具体方法6.胚胎移植4）用