3.2.1目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。从社会中来你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗?

培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤?3.2基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序：1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。抗逆性基因生产药物基因毒物降解基因工业用酶基因资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。一、目的基因的筛选与获取2.筛选目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。测序技术序列数据库（如GenBank）序列比对工具（如BLAST）测定核酸和蛋白质序列以碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容的分子生物信息数据库把感兴趣的序列跟已经存在的序列数据库进行比较的工具。通过比对识别相关的序列，从而能获得目的基因和蛋白质的功能。一、目的基因的筛选与获取将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，结合质粒导入受体菌群体中储存，这个受体菌群就是该生物的基因文库。3.获取目的基因（1）从基因文库中获取目的基因一、目的基因的筛选与获取（基因序列已知）基因组文库部分基因文库（如：cDNA文库）cDNA文库：由mRNA逆转录产生的互补的DNA。一、目的基因的筛选与获取①建立基因组文库：提取基因组DNA限制酶DNA片段与载体连接重组载体导入受体菌基因组文库一、目的基因的筛选与获取②建立cDNA文库：成熟mRNA逆转录酶单链DNADNA聚合酶双链DNA（cDNA）与载体连接导入受体菌中储存cDNA文库3.获取目的基因（3）利用PCR获取和扩增目的基因（已知目的基因的核苷酸序列，且基因较小）（2）人工合成法反转录法DNA合成仪DNA合成仪一、目的基因的筛选与获取（聚合酶链式反应）原理：DNA半保留复制缓冲液一、目的基因的筛选与获取（3）利用PCR获取和扩增目的基因条件：PCR仪耐高温的DNA聚合酶4种脱氧核苷酸分别与两条模板链结合的2种引物DNA模板（DNA聚合酶需要Mg+激活）一、目的基因的筛选与获取思考：什么是引物？引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物；细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物。引物为DNA聚合酶提供了游离的3’端，使DNA聚合酶从3’端延伸子链。一、目的基因的筛选与获取思考：为什么子链合成需要引物？DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链。由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种（一对）引物。（DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能）比较项目细胞内DNA复制PCR技术区别解旋方式场所酶温度是否需要ATP结果联系DNA在高温下变性解旋细胞外（主要在PCR扩增仪内）耐高温的DNA聚合酶解旋酶催化主要在细胞核内解旋酶、DNA聚合酶等细胞内，温和条件控制温度，需在不同温度下进行需要不需要合成整个DNA分子扩增特定的DNA片段或基因①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板②原料：4种脱氧核苷酸③酶：均需DNA聚合酶④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3’端合成子链PCR所用原料实为脱氧核苷三磷酸

dNTP一、目的基因的筛选与获取既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。脱氧腺苷三磷酸dATP脱氧鸟苷三磷酸dGTP脱氧胸苷三磷酸dTTP脱氧胞苷三磷酸dCTP耐高温的DNA聚合酶4种脱氧核苷酸引物待扩增的DNA片段3’3’PCR扩增过程变性温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链复性当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。延伸当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。GC含量高，复性温度高第一次循环90℃以上，DNA双链解开72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’50℃左右，引物与DNA结合第二次循环5’3’5’5’3’5’高温变性、低温复性、中温延伸第三次循环3’5’高温变性、低温复性、中温延伸思考：至少要经过几次循环才能分离出目的基因？（两条脱氧核苷酸链等长的基因）三次一、目的基因的筛选与获取思考：用PCR可以扩增mRNA吗？不可以！需要将RNA逆转录为cDNA，然后再进行扩增。单链RNA杂交双链逆转录酶核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链单链DNADNA聚合酶双链DNA一、目的基因的筛选与获取1.设计引物的依据是：

。3.使用的2种（一对）引物的序列相同吗？

_________________________________________2.脱氧核苷酸连接在引物的_____端进行延伸，子链的延伸方向

。

已知目的基因两端（3’端）的部分核苷酸序列不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列3’5’→3’②每种引物内部不能发生局部碱基互补配对①两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对一、目的基因的筛选与获取4.引物设计的要求（引物失效的原因）:引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。引物Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。（一般不能有两个以上）5.一个DNA，通过PCR扩增n次：①子代DNA分子数为：______个②子代DNA分子中含模板链DNA分子数为：_____个③复制过程中共需引物____________个（

对）④第n次复制需要引物_______个2n22n＋1-22n一、目的基因的筛选与获取2n-16.要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。一、目的基因的筛选与获取思考：如何对产物进行鉴定？琼脂糖凝胶电泳DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。DNA混合物－最长最短一、目的基因的筛选与获取思考：如果直接把目的基因导入受体细胞，可能会出现什么样的结果？

如何避免该结果的发生呢？游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传（通常不具有自我复制的能力）。二、基因表达载体的构建一、基因表达载体的作用1.使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；2.使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。二、基因表达载体的组成载体

表达载体：必须有启动子、终止子等≠载体表达载体克隆载体二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的组成位置：功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。基因的上游（一段有特殊结构的DNA片段）1.启动子有时为了满足应用需要，会在载体上人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的组成位置：功能：终止mRNA的转录基因的下游（一段有特殊结构的DNA片段）2.终止子用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞标记基因：复制原点Ori：DNA聚合酶的结合位点，DNA复制的起始位点二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ限制酶切割质粒？为什么？不能。因为SmaⅠ切割会破坏质粒的抗生素抗性基因。质粒上的抗性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。二、基因表达载体的构建2.只使用EcoRⅠ分别切割质粒和外源DNA，能否构建基因表达载体？能①质粒、目的基因会发生自身环化连接；③会发生两两自身连接。②质粒与目的基因会发生反向连接；有何弊端？二、基因表达载体的构建3.与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？①防止质粒、目的基因的自身环化连接；②防止目的基因与载体的反向连接。习题巩固可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒。为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接（或为了保证目的基因和质粒发生定向连接），可选用什么限制酶？二、基因表达载体的构建①选目的基因两端和运载体都有的酶切位点（或产生相同末端）；1.选择酶切位点的原则：③保证目的基因插到启动子与终止子之间的部位。②所选酶切位点不能破坏目的基因和所有的标记基因；2.不用单酶切（或产生相同末端的两种限制酶）的原因：①质粒、目的基因会发生自身环化连接；③会发生两两自身连接。②质粒与目的基因会发生反向连接；（载体-载体，目的基因-目的基因，载体-目的基因）使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？自连（环化）片段间的连接目的基因自连质粒自连目的基因与质粒连接目的基因与目的基因连接质粒与质粒连接目的基因11’载体22’正向连接122’1’二、基因表达载体的构建22’1’1反向连接某目基因两侧的DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示，下列可作该目的基因最佳载体的是（

）

A习题巩固ABCD习题巩固A.用限制酶Hind

Ⅲ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段B.不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因C.构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和Pst

Ⅰ酶同时切割质粒和外源DNAD.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长利用质粒（图甲）和目的基因（图乙）构建重组DNA，下列错误的是（

）C二、基因表达载体的构建三、基因表达载体的构建过程①首先用一定的

切割载体，使它出现一个切口。②然后用

限制酶或能产生

末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③再利用

将含目的基因的DNA片段拼接到的

切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。限制酶同种相同DNA连接酶载体二、基因表达载体的构建思考：将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？

如果这么做，效果会怎样？这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。（1）构建基因表达载体时需要使用的工具酶为

。

（2）用图中的质粒和DNA构建基因表达载体时，不能使用SmaⅠ切割，原因