义翘讲堂《全面的WB实验疑难解析及磷酸化蛋白检测技巧》

全面的WB实验疑难解析及磷酸化蛋白检测技巧滕敏高级质控工程师北京义翘神州科技股份有限公司免疫实验技术全攻略CONTENTWesternBlot技术介绍1WesternBlot常见问题解析2磷酸化蛋白检测技巧3WesternBlot保证型抗体开发4义翘神州WesternBlot技术介绍01义翘神州WB（免疫印迹）技术概览样本（蛋白质）电泳分离利用聚丙烯酰胺凝胶按照蛋白质的分子量大小进行分离样本转移到固相支持物例如：NC膜或PVDF膜检测目的蛋白孵育一抗和二抗目的蛋白可视化化学发光等检测方法优势高特异性、高灵敏度能够在复杂的蛋白质混合物中精准地检测到特定的目标蛋白应用场景生物医学研究、疾病诊断、药物研发等在癌症研究中，可以检测肿瘤相关蛋白的表达水平变化在免疫学研究中，能够分析免疫细胞中特定免疫分子的表达情况WesternBlot技术介绍4样品制备电泳转膜（湿法）抗体孵育目的蛋白可视化检测化学发光仪荧光成像系统WB显色展示5WesternBlot技术介绍WB实验流程概述细胞样品制备组织样品制备细胞收集组织破碎加预冷的裂解液加预冷的裂解液，研磨仪研磨样品类型样本收集样本洗涤样本预处理样本制备6预冷PBS洗涤低温裂解，超声WesternBlot技术介绍WB实验技术要点---样本制备RIPA裂解液：成分较为复杂，包含离子型、非离子型去污剂和去垢剂，能有效裂解细胞并溶解蛋白，用于WB等实验

NP

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40裂解液：非离子型去污剂，性质相对温和，在裂解细胞的同时可以保持蛋白的天然状态，用于IP实验分离胶浓度目标蛋白分子量7.5%80-300kDa10%30-300kDa13%10-100kDa15%5-70kDaTris-甘氨酸电泳系统Bis-Tris电泳系统浓缩胶60-80V70-90V分离胶100-120V120-150VpH8.35.8-7.2电泳过程是不同分子量蛋白进行分离，这是个产热过程，必要情况需增加冷却装置。7分离范围分离相对分子质量范围较宽的蛋白质适合分离等电点接近，分子量差异小的蛋白质WesternBlot技术介绍WB实验技术要点---电泳目标蛋白分子量湿法转膜时间80-300kDa110V,150min30-180kDa110V,90min10-60kDa110V,60min蛋白分子量与转膜时间湿法转膜和半干转膜的区别

湿法转膜半干转膜仪器湿法转膜仪半干转膜仪时长长(90-150min)短(30-90min)转膜液用量多少转膜效率高低于湿法膜背景低高适合分子量所有<100kDa8滤纸滤纸胶膜-+转膜示意图WesternBlot技术介绍WB实验技术要点---转膜目标蛋白信息：分子量、氨基酸序列、结构特点、翻译后修饰样本类型：明确样本来源：人、动物、植物、细胞系广泛引用的抗体通常具有较高的可靠性和适用性试用装：您可向义翘神州申请试用装，用以测试抗体在实际实验中的性能。

可以避免购买到不适合实验的抗体减少不必要的损失特异性：高特异性的抗体能够准确地识别目标蛋白，而不与其他蛋白发生交叉反应亲和力：高效价的抗体具备更高的灵敏度，可检测更低浓度的蛋白该抗体已被验证具备WB应用义翘神州磷酸化抗体：均经WB应用验证，具备高特异性明确检测目标高引用的抗体抗体性能评估

应用验证品牌较强抗体开发实力的品牌具备更高品质的WB应用抗体。义翘神州WB应用抗体：覆盖热门靶点包涵磷酸化抗体、标签抗体、内参抗体、二抗

涵盖各种属9WesternBlot技术介绍WB实验技术要点---一抗、二抗的选择样本类型内参蛋白分子量表达特性适用条件不适用条件胞浆和全细胞β-Actin43kDa结构蛋白，不同组织的细胞结果会有差异诱导后样本或检测磷酸化等修饰后样本血红细胞、无细胞结构样本，如血浆、组织液α-Actin43kDaβ-tubulin50kDaα-tubulin55

kDaGAPDH36kDa代谢类蛋白，在活组织中表达恒定，诱导处理影响表达量多组织多样本比对表达量时可选GAPDH核蛋白PCAN29kDa细胞周期内表达稳定细胞核内蛋白检测胞质血清transferrin77kDa转铁蛋白在血清中相对稳定血清疾病血清内参蛋白要与目标蛋白分子量相差10kDa以上常用内参抗体推荐：beta-Actin(Cat#:100166-MM10)、beta-Tubulin(Cat#:100109-MM05T)、GAPDH(Cat#:100242-MM05)10WesternBlot技术介绍WB实验技术要点---内参的选择彩色长红外染料标记不需底物条带直观可见信号持久可保存半年以上黑白短大多1s完成HRP标记需底物灵敏度高不持久不宜长期保存化学发光成像系统荧光成像系统Odyssey图片适用二抗扫描时间显色信号11WesternBlot技术介绍WB实验技术要点---显色√目的条带单一，无杂带，信号强√

KO验证抗体Cat#:

101887-R003×有其他杂带，信号极弱1302501001803007055AA100705535402515130180×没有信号12WesternBlot技术介绍WB显色结果案例展示用于量化蛋白表达水平，可以作为一种定量数据

条带颜色越深，灰度值越高，蛋白含量越高；反之，条带颜色越浅，蛋白含量越低用于验证实验的可靠性和重复性。在重复实验中，目标蛋白的灰度值变化趋势一致，说明实验结果较为可靠编号ABCDEF条带1灰度值3628257442049021418166849318条带2灰度值03050116167956586015213actin灰度值130742081815015211632521322528比较不同样品中蛋白的表达水平分析蛋白表达的变化趋势验证实验结果13WesternBlot技术介绍WB实验技术要点---灰度值WesternBlot常见问题解析02义翘神州可能的原因解决方案检测样本不表达目的蛋白加高表达阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂抗体不能识别测试种属的相关蛋白仔细确认是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白一抗孵育时间不足4℃结合过夜二抗与一抗不匹配选择针对一抗来源的种属的抗体洗膜过度洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，可使用0.1%的Tween-20转膜不充分/过转优化转膜条件HRP或底物活性降低测试活性或选用敏感底物15WesternBlot常见问题解析WesternBlot结果---无信号或显示信号弱可能的原因解决方案膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液(如5%BSA的TBST)一抗孵育的温度偏高4℃结合过夜一抗、二抗特异性差，和膜有非特异结合选择合适的一抗、二抗HRP过高（背景较高）降低二抗的使用浓度选择的膜容易产生高背景一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF膜低膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润TBST洗脱不足增加洗脱时间、次数、用量曝光时间过长调整合适的曝光时间16WesternBlot常见问题解析WesternBlot结果---背景高描述条带呈笑脸状︶条带两边向下弯曲︵条带上有不显影的圆形部分示例图片原因凝胶不均匀电泳系统温度偏高凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)解决方案改善凝胶配置环境将电泳系统放置冷却装置，降低电压，防止电泳系统温度过高优化配胶过程铺好膜和胶，用滚筒充分按压滚动，去除气泡17WesternBlot常见问题解析WesternBlot结果---带型异常描述条带有纹理（纵向条纹）条带偏斜，向两边扩散条带成点状条带有拖尾现象示例图片原因样品中含有不溶性颗粒电极不平衡上样量过大样品中盐浓度过高样品溶解不好解决方案样品高速离心5min后吸取上清进行上样调整电极降低样品上样量盐离子移动速率高。电泳时，可先低压20V跑30min，使盐离子远离蛋白条带。增加loadingbuffer的用量18WesternBlot常见问题解析WesternBlot结果---带型异常描述反白现象（条带中心位置出现反白）边缘效应（位于膜靠边缘的条带胶弱）黑点或黑斑（膜上多处出现边缘发白的黑点）

示例图片原因条带过曝，目的蛋白含量太高或者一抗、二抗浓度偏高杂交袋封边太靠近膜膜与显色的仪器接触面有气泡解决方案降低蛋白上样量或者调低一抗、二抗的浓度能有效改善杂交袋封边的时候四边都留一些余地，尤其是目的条带出现的一侧，让抗体和膜能充分进行孵育将膜放在显色液里浸泡1-2s，捞出后缓慢放在一起，将气泡赶到另一侧19WesternBlot常见问题解析WesternBlot结果---带型异常Q：为什么各个抗体都要进行WB预实验？A：对WB结果有决定性影响的因素是蛋白表达量、抗体的效价。正确使用抗体可以保证抗体与抗原更加有效的结合。每一个抗体都有其特性，因此我们须通过WB预实验获得背景小，非特异性条带少的实验结果。预实验的内容如下：1）确定一抗的稀释比例和孵育时间；2）选择合适的封闭液及封闭时间；3）调节合适的上样量，使内参条带灰度值趋于一致。Q：抗体检测时样本上样量怎么确定？A：1.细胞裂解液、组织裂解液、膜裂解液，根据BCA测定的总蛋白含量，上样量20-40μg。2.重组蛋白类样品，根据抗体灵敏度和亲和力，上样量2-200ng。20WesternBlot常见问题解析WesternBlot结果---常见问题Q&AQ：抗体使用有哪些注意事项？A：使用抗体前需仔细阅读说明书，了解抗体的保存条件以及不同用途下的推荐稀释比例。不同品牌的抗体的浓度、体积不相同，较高浓度的抗体（>0.5mg/mL）通常性质更稳定。所以购买时应注意比较，经验不足的实验者往往被抗体的体积迷惑，要注意相同质量下低浓度的抗体体积反而更大。Q：抗体室温孵育2h和4℃过夜孵育有什么区别？A：抗体孵育时间需要根据预实验进行优化，一般情况下室温孵育2h能明显先出条带的，可以沿用这个方式；有的抗体，如磷酸化抗体，目标蛋白丰度较低，或抗体效价低，可以4℃过夜孵育，增加目的条带检出的概率。21WesternBlot常见问题解析WesternBlot结果---常见问题Q&A磷酸化蛋白检测技巧03义翘神州蛋白质磷酸化在蛋白质激酶催化下把ATP或GTPγ位磷酸基团转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程。蛋白质蛋白质磷酸化蛋白的重要性：调控细胞信号转导调节酶活性影响蛋白质的定位和稳定性参与细胞周期调控对于理解疾病的发病机制和开发新的治疗方法具有重要意义磷酸化抗体能够检测蛋白质磷酸化状态，反映信号通路活性，为药物开发提供方向。磷酸化蛋白检测磷酸化抗体VS常规抗体磷酸化抗体常规抗体识别位点特异识别磷酸化位点识别蛋白各个位点检测蛋白检测受刺激时蛋白的变化情况及活性状态检测蛋白的表达情况免疫原多肽，磷酸化蛋白多肽，重组蛋白蛋白类型大部分是转录相关因子各种类型磷酸化抗体开发难点：24磷酸化抗体特点磷酸化是一种动态的修饰过程，在不同的生理条件和刺激下，蛋白质的磷酸化位点可能会发生变化磷酸化蛋白丰度低，需要有高灵敏度的抗体来检测由于磷酸化抗体需要特异性地识别磷酸化位点，因此对抗体的特异性要求非常高磷酸化蛋白往往不稳定，容易发生去磷酸化等变化，需要在特定的条件下进行样品处理和保存大体分为3类：兔多克隆抗体、鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体兔单抗因具备更多优势，义翘神州开发的磷酸化抗体均为兔单抗25更多阳性抗体更好的多样性识别更多表位开发人鼠蛋白抗体结构更稳定亲和力更高特异性更好灵敏度更高磷酸化抗体特点磷酸化抗体类型01样本制备02单B细胞介入03抗体筛选04抗体特异性验证对样本进行药物刺激，使目标蛋白磷酸化高水平表达。样本制备关系到能否筛选到合适的磷酸化抗体ELISA筛选后进行WB介入抗体纯化进行磷酸化特异性筛选筛选磷酸化特异性好的WB抗体进行特异性验证26磷酸化抗体开发磷酸化抗体检测流程27样本制备检测高表达细胞系合理的刺激时间磷酸酶抑制剂低温裂解样本保存设置阴阳性对照添加内参、总蛋白抗体封闭液4℃过夜孵育一抗TBST洗液磷酸化蛋白检测磷酸化蛋白检测的注意事项首先可以查阅文献。许多研究论文会提及某些细胞系在特定蛋白磷酸化过程中的高表达情况，比如在研究癌细胞增殖相关的磷酸化蛋白时，某些肿瘤细胞系如HeLa细胞（人宫颈癌细胞）、A549细胞（人肺癌细胞）常常被用于相关研究。可以通过humanproteinatlas等数据库来选择。通过细胞功能相关性来选择细胞。若研究和神经信号传导有关的磷酸化蛋白，就优先选择神经元细胞，像SH-SY5Y细胞（人神经母细胞瘤细胞）这类与神经功能密切相关的细胞系。28样本制备——高表达细胞系doi:10.1128/MCB.00365-16磷酸化蛋白检测样品中蛋白质磷酸化水平较低或不表达，因此需要通过物理或化学方法进行诱导或刺激。不同靶点刺激的时间和强度不同，需要查找文献或进行预实验。刺激需要做到充分但不过量。刺激过久可能会进入负反馈机制，造成检测结果下降。29样本制备——合理的刺激时间1801007050130250300Phospho-VEGFR2(Tyr1175)HUVECcells0025153060minVEGF饥饿-++++++磷酸化蛋白检测kDa18010070130250300Helacells饥饿-++++++++002510203060120minkDaEGFPhospho-ErbB3/HER3(Tyr1289)磷酸酶抑制剂能防止样本的去磷酸化，提高实验的准确性。30MCF-7cells磷酸酶抑制剂推荐：货号产品名称纯度C04-902PhosphataseInhibitors:NSC-663284>98%P16-902PhosphataseInhibitors:Okadaicacid,freeacid>98%(TLC)P16-902CPhosphataseInhibitors:Cantharidin>98%(HPLC)如果检测的蛋白磷酸化位点是酪氨酸，还需添加1μM的原钒酸钠。--++Phosphatase515515minneuregulin-1Phospho-ErbB3/HER3(Tyr1289)kDa磷酸化蛋白检测样本制备——磷酸酶抑制剂样本低温处理样本常温处理样本在冰上或冰盒中处理持续保持样品低温31VSHEK293cellsUV3510070554025151301801h2hkDaPhospho-Chk1(Ser317)3510070554025151301801h2hUVkDaPhospho-Chk1(Ser317)HEK293cells磷酸化蛋白检测样本制备——低温裂解样本保存：建议-80℃保存处理好后分装存储，不要反复冻融新鲜样本32351007055402515130180-+UV,1hkDaHEK293cells351007055402515130180-+UV,1hkDaPhospho-Chk1(Ser345)-20℃保存6个月后的样本HEK293cells样本降解，无目的条带磷酸化蛋白检测样本制备——样本保存VS阴性样本确定背景信号：通过比较阴性样本和实验样本的信号强度，可以区分真正的磷酸化信号和假阳性信号。验证实验特异性：如果在理论上不应该出现磷酸化的情况下（如未进行特定刺激或处理的样本）检测到了磷酸化信号，那么可能存在实验方法的问题或者抗体的非特异性结合。这有助于确保实验结果的准确性，避免误判

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阳性样本验证实验有效：如果阳性样本中没有检测到预期的磷酸化信号，那么可能是实验过程中出现了问题，如抗体失效、实验条件不合适等。通过阳性样本的检测，可以及时发现问题并采取相应的措施进行调整。提供参考标准：阳性样本可以作为参考标准，帮助确定磷酸化信号的强度范围和变化趋势。33Phospho-Chk1(Ser317)AntibodyCat:111279-R0045Phospho-CREB(Ser133)AntibodyCat:110398-T40磷酸化蛋白检测检测关键点——设置阴阳性对照总蛋白抗体反映蛋白总量变化：确定磷酸化蛋白在总蛋白中的比例变化。排除非磷酸化因素影响：细胞内的许多因素，如转录水平调控、蛋白质合成与降解等，都可能影响蛋白的总量。通过检测总蛋白，可以区分这些非磷酸化相关因素对蛋白表达的影响，更准确地判断磷酸化修饰在特定生理过程中的作用。

Phospho-Chk1(Ser317)AntibodyCat:111279-R0045内参抗体标准化实验结果：对不同样品之间的蛋白上样量、转膜效率等实验因素进行标准化，避免因实验操作误差导致的结果偏差。验证实验可靠性：内参抗体的检测结果可以作为实验质量控制的指标。Phospho-HER2/ErbB2(Tyr1221,

1222)AntibodyCat:111140-R002334磷酸化蛋白检测检测关键点——添加内参、总蛋白抗体35封闭液主要有2种，BSA和脱脂奶粉。检测磷酸化蛋白建议使用BSA做封闭液降低非特异结合，减少背景干扰，提高信噪比影响抗体结合效率：合适的封闭液可以为抗体提供良好的结合环境；保持抗体活性奶粉中含有酪蛋白，产生高背景信号残留的磷酸酶，影响磷酸化蛋白的检测准确性奶粉批间一致差，不利于实验的重复性封闭液的作用为什么不建议用奶粉？磷酸化蛋白检测检测关键点——封闭液36磷酸化蛋白丰度低，室温孵育2h不易检出，可4℃过夜孵育一抗，增加检出率。充分反应：低温能够使抗体与目的蛋白之间有更充分的接触和反应机会，提高结合的效率和特异性。减少非特异性结合：在较高温度下，抗体可能会与非目的蛋白或其他杂质发生非特异性结合。增加结合量：长时间的孵育可以使更多的抗体结合到目的蛋白上，从而增加检测信号的强度。稳定结合：低温下抗体与目的蛋白的结合更加稳定，后续的洗涤和检测步骤中减少信号的丢失。4℃过夜孵育的条件相对稳定，实验的可重复性较好。增强信号强度可重复性好提高结合效率磷酸化蛋白检测检测关键点——4℃过夜孵育一抗去除非特异性结合降低背景噪音；提高特异性维持实验条件稳定控制离子强度和pH值；防止蛋白降解提高实验可重复性标准化实验步骤；减少实验误差37洗液一般用TBST、PBST，检测磷酸化蛋白建议使用TBST洗液离子强度影响PBST中的磷酸盐缓冲液和氯化钠可能会影响抗体与磷酸化位点的结合。pH值影响PBST的pH值可能对磷酸化检测产生影响。如果pH值不合适，可能影响抗体的活性或蛋白质的稳定性，从而干扰检测。洗液的作用为什么不建议用PBST？磷酸化蛋白检测检测关键点——TBST洗液SinoBiological,Inc.靶点概述：促进血管生成：VEGFR2(Tyr1175)在血管生成中扮演关键角色，其磷酸化激活后触发信号传导，促进新血管形成。肿瘤治疗的潜在靶点：抑制VEGFR2(Tyr1175)活性可以阻断血管生成信号，从而抑制肿瘤生长和扩散，目前有多款药物在研。眼部疾病治疗的希望：通过抑制VEGFR2(Tyr1175)，减少异常血管生成，保护视网膜，治疗相关眼部疾病。单B细胞介入：单B细胞介入用经药物刺激的HUVEC细胞裂解液进行筛选VEGFReceptor2(Tyr1175)靶点介入共检测68个，其中13株强阳性，11株弱阳性。筛选结果如下图：高特异性磷酸化抗体Phospho-VEGFReceptor2(Tyr1175)兔单抗（Cat#:111431-R0010）抗体筛选结果：3株阳性克隆。选取R0010进行大量生产，并进行WB特异性验证HUVEC血清饥饿过夜后，VEGF(Cat#:11066-HNAH)50ng/ml2min，每个泳道30μg上样量A:PositivecontrolantibodyB:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0004C:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0007D:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0010E:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0011F:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0013G:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0015H:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0017I:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0019J:HPV16-SMCC-SinoA11431-R0020K:HPV16-SMCC-SinoA11431-R002239高特异性磷酸化抗体Phospho-VEGFReceptor2(Tyr1175)兔单抗（Cat#:111431-R0010）WB特异性验证：天然样品验证

多肽阻断HUVEC

磷酸酶处理膜HUVECHUVECPhospho-VEGFReceptor2(Tyr1175)兔单抗（Cat#:111431-R0010）抗体特异性识别磷酸化蛋白VEGFR2(Tyr1175)：磷酸化多肽可以阻断抗体与细胞裂解的结合，磷酸酶处理膜后特异性磷酸化抗体和膜无结合40高特异性磷酸化抗体现货磷酸化抗体货号靶点109513-R0006mTOR(Ser2448)110547-R0002Akt(Thr308)109860-R00144E-BP1(Thr37/46)110565-R0009Chk1(Ser345)109859-R0016HistoneH2A.X(Ser139)110483-R0126HistoneH3(Ser10)111150-R0005PTEN(Ser380)110396-R0001p70S6Kinase1(Thr389)110591-R0113AKT(Ser473)110848-R0056AKT1(Thr450)110457-R0011eIF2α(Ser51)110441-R0072ERK1/2(Thr202,Tyr204)110455-R0016GSK3beta(Ser9)110435-R0004p38MAPK(Thr180,Tyr182)货号靶点111378-R0002NF-κBp65(Ser536)111277-R0032Chk2(Thr68)111138-R0019IGF1R(Tyr1131)/InsulinReceptorβ(Tyr1146)110470-R0008MEK1/2(Ser217,221)111301-R0019cdc2(Tyr15)111168-R0044Stat6(Tyr641)111170-R0024PLCγ1(Tyr783)111421-R0003Paxillin(Tyr118)111461-R0007c-Jun(Ser73)111172-R0049PKCα(Thr638)PKCβII(Thr641)111160-R0021Stat5(Tyr694)111160-R0023Stat5(Ty