义翘讲堂《免疫组化（IHC）实验技术介绍及IHC抗体开发案例分享》

IHC结果分析、疑难解析，分享IHC抗体筛选策略李天月北京义翘神州科技股份有限公司免疫实验技术全攻略CONTENTIHC技术流程与结果分析1义翘神州IHC常见问题及解决方法2IHC抗体开发案例分享3IHC技术流程与结果分析01义翘神州免疫组织化学（IHC），是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过酶标抗体与底物反应显色，从而对组织细胞内抗原进行定位、定性及定量的研究。IHC染色原理义翘神州组织取样固定脱水包埋切片样本切片制备切片免疫染色CellAntigenPrimaryAntibodyConjugatedSecondaryAntibody底物有色产物IHC技术流程15脱蜡水化抗原修复灭活过氧化物酶24678封闭一抗孵育二抗孵育显色10111293义翘神州Uniprot数据库：/IHC染色结果分析SinoBiological官网：/抗原信息抗体信息表达定位表达强度计量方法文献：/人类蛋白图谱数据库：/义翘神州IHC染色结果分析抗原信息抗体信息表达定位表达强度计量方法义翘神州Ki67/MKI67Antibody,MouseMAbCat#:100130-MM19IHCstainingofhumanKI-67in

humanlungcancerwithmousemAb(1:60,formalin-fixedparaffinembeddedsections).IHCstainingofhumanKI-67in

humanbreastcarcinomawithmousemAb(1:60,formalin-fixe

dparaffinembeddedsections).IHCstainingofhumanKI-67in

humanesophagealcarcinomawithmousemAb(1:60,formalin-fixe

dparaffinembeddedsections).义翘神州IHC染色结果分析MembranoushumanbreastcarcinomaAnti-Her2/ERBB2Antibody,MouseMonoclonal(Cat:

10004-MM40)NuclearhumantonsilAnti-Ki67/MKI67Antibody,MouseMonoclonal(Cat:

100130-MM19)CytoplasmhumanliverAnti-P4HBAntibody,RabbitPolyclonal(Cat:

310904-T42)CytoplasmandnucleushumanmalignantmelanomaRecombinantAnti-S100BAntibody,RabbitMonoclonal(Cat:

100508-R034)CytoplasmandmembranehumancolonRecombinantAnti-CES3Antibody,RabbitMonoclonal(Cat:

11129-R033)IHC染色结果分析抗原信息抗体信息表达定位表达强度计量方法义翘神州淡黄色+棕黄色++棕黑色+++IHC染色结果分析抗原信息抗体信息表达定位表达强度计量方法义翘神州

阳性细胞数量染色强度弱阳性，1分（阳性细胞数＜25%）中等阳性，2分（25%＜阳性细胞数＜49%）强阳性，3分（阳性细胞数＞50%）弱阳性（+）1分2（阴性）3（阴性）4（阳性）中等阳性（++）2分3（阴性）4（阳性）5（强阳性）强阳性（+++）3分4（阳性）5（强阳性）6（强阳性）IHC染色结果分析抗原信息抗体信息表达定位表达强度计量方法义翘神州ImageJ1FIJI图片来自NewDiscoveryIHC常见问题及解决方法02义翘神州高背景非特异染色无染色义翘神州抗体工作浓度过高抗体本身质量问题抗体孵育时间过长，或孵育温度过高封闭不完全抗原修复方式不合适二抗发生非特异结合洗涤次数不足DAB显色时间太长，显色浓度过高抗体工作浓度低，孵育时间短一抗和二抗是否匹配抗体保存不当（反复冻融）检测组织中不存在目的蛋白组织中目标蛋白丰度不够稀释液和洗液的配制是否有误更换抗原修复方法抗体工作浓度过高抗体本身特异性不佳内源性过氧化物酶活性二抗发生非特异结合一抗的种属来源与组织样本的种属相同（例如，用小鼠一抗测试小鼠组织）切片干片组织内部坏死区域高背景非特异染色无染色边缘效应染料斑点加液量充足保持切片湿润，避免干片DAB显色剂是否过期二抗是否过期，是否有聚集气泡假象染色不均匀轻柔混匀滴加液体，避免气泡产生检查台面是否倾斜避免直接从热的修复液取出义翘神州IHC抗体开发案例分享03义翘神州义翘神州杂交瘤技术噬菌体展示文库技术单B细胞分选技术高效的抗体开发技术平台：经典技术优化：电融合，建库技术新技术：单个B细胞技术，更快的速度多种筛选方案组合高效的重组抗体表达高质量的候选抗体库：数百-数千个候选抗体亲和力达到nM-pM水平不同的抗原结合表位适用于不同应用场景Beacon®技术

四大单克隆抗体制备技术抗原设计表位差异性构象正确性抗原易获得性1免疫方案高滴度免疫效价多表位免疫反应识别功能位点2抗体筛选多样化筛选平台快速精准筛选鉴别多功能抗体3表达生产减少外源污染高产能（≥mg级）高通量4质控验证理化检测免疫学检测生物安全检测……5抗体平台关键技术环节义翘神州佐剂：弗氏佐剂、铝佐剂、MF59、QS21Titermax、Mn、MPL免疫途径：皮内、皮下、腹腔、静脉、淋巴结、脾内免疫周期：常规（7~12周）、快速（3周、5周）免疫剂量：小鼠10~100μg/只次；兔100~500μg/只次……根据最终需求选择合适的免疫原、佐剂、免疫方式动物免疫效价检测筛选方式ELISA效价检测为主，辅助IHC检测多样化抗体筛选平台，关键环节进行IHC功能介入筛选IHC指定功能的抗体开发功能需求为导向，尽早开展应用特异性筛选义翘神州案例一：MKI67(Cat:

100130-MM19)抗体筛选鼠上清首筛介入鼠上清亚克隆介入单抗小样初筛单抗小样多组织复筛安排大样生产鼠血清介入单抗大样多组织复筛单抗大样初筛灵敏度验证特异性验证稳定性验证其他验证IVD原料级别义翘神州案例一：MKI67(Cat:

100130-MM19)抗体筛选操作流程：多肽免疫5只小鼠，免疫血清进行ELISA效价检测和IHC筛选（2个阳性组织、1个阴性组织）挑选ELISA及IHC均合格的1只小鼠融合主克隆阶段，ELISA&IHC（双组织）-->200株结合阳性，首批73株IHC检测；挑选12株合格克隆进行稳定株筛选2~3次有限稀释，ELISA&IHC（多组织）--获得11株ELISA与IHC合格抗体；挑选最优的6株克隆放大生产及抗体纯化抗体质控--1株抗体IHC多组织验证阳性，可作为诊断原料；3株抗体满足科研试剂要求Control37℃1week37℃2week0.1μg/mL1μg/mL5μg/mL抗体灵敏度验证抗体特异性验证加速稳定性验证抗体经多方面验证合格，满足诊断原料需求案例二：Claudin18抗体(Cat:

109916-R179)靶点抗体筛选胃癌1胃癌2胃癌3胃癌4胃癌5胃癌6胃癌7胃癌8胰腺癌1胰腺癌2胃癌1胃癌2胃癌3胃癌4胃癌5胃癌6胃癌7胃癌8胰腺癌1胰腺癌2市售诊断抗体

（3μg/mL）Sinobiological（1μg/mL）义翘神州Claudin18抗体正常组织的表达情况扁桃体胆囊肝睾丸肌肉甲状腺结肠阑尾淋巴结脑皮肤脾气管前列腺乳腺肾肾上腺食管胎盘小肠心胸腺胰腺支气管直肠义翘神州IHC应用抗体共4421株SpeciesQtyHuman3861Mouse399Rat94Rhesus22Cynomolgus15SARS23AntibodyTypeQtyRabbitPAb3880RabbitMAb306MouseMAb230ChimeraMAb5ProductnameCatalogNumberDescriptionIsotypeCD2011007-MM06MouseMAbMouseIgG1CD2110811-MM28MouseMAbMouseIgG1CD3CT026-R301RabbitMAbRabbitIgGCD3410103-MM17MouseMAbMouseIgG1CD6811192-R179RabbitMAbRabbitIgGCD79a100128-R001RabbitMAbRabbitIgGKi-67100130-MM19MouseMAbMouseIgG1LCA100342-R145RabbitMAbRabbitIgGMSH6100973-R035RabbitMAbRabbitIgGMSLN13128-MM01MouseMAbMouseIgG1p5390001-R002RabbitMAbRabbitIgGp63100266-R143RabbitMAbRabbitIgGPD-110377-MM23MouseMAbMouseIgG1S100100508-R034RabbitMAbRabbitIgG100508-MM03MouseMAbMouseIgG1Vimentin100254-R001RabbitMAbRabbitIgG义翘神州义翘神州“一站式”试剂与技术服务蛋白表达和纯化服务多种重组蛋白表达系统基因合成密码子优化载体构建蛋白表达纯化抗体表达和纯化服务单克隆抗体多克隆抗体磷酸化抗体抗独特型（Anti-idiotype）抗体嵌合抗体WB/IHC保证型抗体制备ELISA试剂盒开发……生物分析检测服务SPR/BLI分子互作检测FcRn结合检测服务SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike假病毒中和检测体外活性检测技术服务生物安全检测服务CMA&CNAS认证的病毒清除工艺验证服务双C认证的细胞库检测服务免疫学检测服务WesternBlot检测服务流式细胞检测技术服务ELISA/ELISpot检测技术服务IHC/IF检测技术服务IP/Co-IP技术服务坚持自主研发生产打造中国生命科学研究“一站式”试剂与服务支撑平台人才与设施荣誉资质设施：

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