医院医技科室诊疗规范

医院医技科室诊疗规范第2章病理学基本技术规范第一节病理组织学诊断检材的制备技术一、组织的固定㈠凡需要进行病理组织学检查的标本(器官或组织)，于离体(活体或尸体)后，应尽快置放(浸泡)于装有足够量固定液的容器中固定。固定液量应为被固定标本体积的5~10倍。置放标本的容器大小视标本和固定液的体积而定，应适当大一些。临床科室切取的标本置放于容器中固定后，应尽快送交病理科继续固定。未能及时、充分固定的干涸或腐败标本不能再进行固定和用于制做切片。㈡常规固定液为4%中性甲醛(10%中性福尔马林)，应预先多量配制贮存，以备随时使用。小标本的固定时间为4~6小时，大标本为18~24小时或更久。㈢根据病理学特殊检查(特殊染色和组织化学染色、免疫组织化学染色和原位核酸分子杂交染色、电镜观察等)的需要，应选用其他适宜的固定液进行固定[参见后述的“㈦固定液的常用种类和制备”]。㈣器官、组织固定的基本方法[另参见本章第四节(病理标本的肉眼检查和组织学切片取材技术)]1.食管、胃、肠、胆囊、膀胱等空腔器官：依规范方法剪开后，按其自然状态平铺于硬纸板上(重点暴露黏膜面或内表面的病变处)，并用大头针将标本边缘处固定于纸板上，然后放入4%中性甲醛中固定(黏膜面或内表面朝向容器的液面，并覆盖薄层脱脂棉)。2.肝、脾：由器官背面，沿其长轴每间隔1.5~2.0cm纵向平行剖开，切成数片。将每片肝或脾轻轻地平放于装有4%中性甲醛的容器中，容器底面衬以脱脂棉。应避免标本弯曲和相互间的叠压。3.肺叶：放入固定液中的肺叶漂浮于液面，需在肺表面覆盖薄层脱脂棉。必要时从支气管注入适量4%中性甲醛。4.肾：沿肾外缘中线朝肾门方向作一水平切面(深达于肾盏)，再行固定。5.淋巴结：先用4%中性甲醛固定1小时后，再沿其长轴切成数片(厚2~3mm)，继续固定。6.骨组织：先锯成小片(若是长骨应作横向锯片)，在4%中性甲醛中固定24小时后，再进行脱钙。7.微小组织或液体沉淀物：先用拭纸或滤纸妥为包裹(需用大头针扎牢)，然后放入专用小盒内进行中性4%甲醛固定，以防检材遗失。8.凡进入固定程序的标本必须连带其正确无误的病理检验号(病理号)。㈤多数固定液对人体有害，需要防护，必须在封闭的通风条件下进行操作。㈥组织块的切取和固定：①由较大标本切取用于制作切片的组织块(取材)时，应与标本的断面平行，组织块厚度一般为0.3cm(不应>0.5cm)，面积一般在1~1.5×1~1.5以内。②切取组织块的形状，在充分包括肉眼病变的前提下尽量规则些(例如方形、矩形、三角形等);由一个标本切取的多块组织的形状有所不同，便于蜡块与其相应切片的核对。③固定组织块的固定液量，一般应为组织块总体积的5~10倍以上。④室内常温(25℃左右)下的固定时间为3~24小时;低温(4℃)下的固定时间应延长。⑤固定组织块的容器要大一些。⑥组织块固定期间需要间断地轻摇或搅动固定液以利于固定液的渗入。㈦常用固定液1.4%中性甲醛(10%中性福尔马林)固定液甲醛(40%)100ml无水磷酸氢二钠6.5g磷酸二氢钠4.0g蒸馏水900ml2.乙醇-甲醛(酒精-福尔马林，AF)固定液甲醛(40%)100ml95%乙醇900ml[说明]一般组织块经乙醇-甲醛固定1～2小时后，即可移入95%乙醇内脱水。3.Carnoy固定液无水乙醇60ml氯仿30ml冰醋酸10ml[说明]组织化学染色的常用固定液，组织经Carnoy液固定1～2小时后，即可移入无水乙醇中脱水。4.Zenker固定液升汞5.0g重铬酸钾2.5g硫酸钠1.0g蒸馏水(加至)100ml[说明]配制本液时，先将升汞溶于蒸馏水中、加温至40～50℃溶解后，再加入重铬酸钾，最后加入硫酸钠，贮存待用。使用前加入5ml冰醋酸，混合。组织块需固定12~24小时。切片染色前，需进行脱汞沉淀处理。5.Bouin固定液饱和苦味酸水溶液(约1.22%)75ml甲醛(40%)25ml冰醋酸5ml[说明]本液临用时配制。组织块置于Bouin液固定12～24小时即可(小块组织只需固定数小时)。经Bouin液固定的组织被苦味酸染成黄色，可用水洗涤12小时后进入乙醇脱水(兼脱色)。不必将组织中的黄色除净(残存于组织中的苦味酸无碍染色)6.过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液(PLP)A液：赖氨酸1.827g蒸馏水50ml0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)50mlB液：8%多聚甲醛水溶液100ml[说明]本液临用时配制：取A液3份、B液1份，混合后，加入过碘酸钠，使液体终浓度为2%。组织块在4℃下固定36~54小时。本液对细胞结构和抗原性保存较好。7.B5(醋酸钠-升汞-甲醛)固定液无水醋酸钠1.25g升汞6.0g蒸馏水90ml[说明]将以上物质混合、溶解，使用前加入甲醛10ml。本液多用于固定淋巴组织。染色前应进行脱汞沉淀处理。如不加甲醛称为B4固定液(蒸馏水为100ml)。8.丙酮固定液冷丙酮(4℃)固定液用于酶组织化学染色。细胞标本的免疫组化染色也常用冷丙酮固定10分钟。二、常规石蜡包埋组织切片(常规切片)的制备㈠组织块依序进行：①水洗，②脱水，③透明，④浸蜡，⑤包埋和⑥切片。㈡组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。㈢常规切片的手工操作(步骤次序和各步骤的持续时间)1.水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。2.脱水(常温下)(1)乙醇-甲醛(AF)液固定60~120min(2)80%乙醇60~120min(3)95%乙醇Ⅰ60~120min(4)95%乙醇Ⅱ60~120min(5)无水乙醇Ⅰ60~120min(6)无水乙醇Ⅱ60~120min(7)无水乙醇Ⅲ60min[注意事项]①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。④脱水试剂应及时过滤、更换(500ml乙醇可用于500个组织块脱水;加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换)。⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长(以免硬化)。⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。3.透明(1)二甲苯Ⅰ20min(2)二甲苯Ⅱ20min(3)二甲苯Ⅲ20min[注意事项]①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长(以防组织硬、脆)，并依不同种类组织及其大小而异;组织呈现棕黄或暗红色透明即可。③二甲苯应及时过滤、更换。④组织经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。4.浸蜡(1)石蜡Ⅰ(45~50℃)60min(2)石蜡Ⅱ(56~58℃)60min(3)石蜡Ⅲ(56~58℃)60min[注意事项]①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中(70℃)进行，不得用明火加温。②熔蜡的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。③组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔蜡中。④浸蜡时间适宜，过短时浸蜡不充分(组织过软)，过长时组织硬脆。⑤熔蜡应及时过滤、更换。5.包埋(1)先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲钝头镊子轻轻夹取已经过浸蜡的组织块，使组织块的最大面或被特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中;应将组织块平正地置放于包埋模具底面的中央处;包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近并位于同一平面上;腔壁、皮肤和黏膜组织必须垂直包埋(立埋)。(2)将与组织块相关的病理号小条置入包埋模具内熔蜡的一侧。(3)待包埋模具内的熔蜡表面凝固后，即将模具移入冷水中加速凝固。(4)从包埋模具中取出凝固的包埋蜡块(简称蜡快)，用刀片去除组织块周围的过多石蜡(组织块周围保留1~2mm石蜡为宜)。将包埋蜡块修整成为规则的正方形或长方形。(5)将病理号小条牢固地烙贴在蜡块一侧(编号应清晰可见)。(6)把修整好的蜡块烙贴在支持器上，以备切片。(7)使用包埋机的方法按有关厂商的说明书操作。(8)注意事项①应将组织块严格分件包埋。包埋时一定要首先认真核对组织块的病理号(包括亚号)、块数和取材医师对包埋面的要求，准确地包入相应的病理号小条。发生包埋差错时，必须立即与取材医师和病理科当班负责人取得联系，及时处置。②必须严防各种异物污染，勿将无关组织(包括缝线、纸屑或其他异物(尤其是硬质异物)埋入蜡块内。③包埋过程要操作迅速，以免组织块尚未埋妥前熔蜡凝固。④包埋用的熔蜡应纯净，熔点适宜。浸蜡Ⅰ用软蜡(熔点为45~50℃)，浸蜡Ⅱ、Ⅲ和包埋用蜡均用硬蜡(熔点为56~58℃)。⑤包埋用熔蜡使用前应将先静置沉淀、过滤。⑥熔蜡时不得使用明火，以防燃烧。包埋用熔蜡的温度应<65℃;包埋用的镊子不可加温过高，以免烫伤组织。6.切片(1)切片刀或一次性切片刀片必须锋利。使用切片刀时，必须精心磨备(在低倍显微镜下确认刀刃无缺口);使用一次性切片刀片时，应及时更新。(2)载玻片必须洁净、光亮。(3)将切片刀或刀片安装在持刀座上(以15°为宜)。(4)将蜡块固定于持支持器上，并调整蜡块和刀刃至适当位置(刀刃与蜡块表面呈5°夹角)。(5)细心移动刀座或蜡块支持器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座和蜡块支持器。(6)修块(粗切)：用右手匀速旋转切片机轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块完整地全部切到。修块粗切片的厚度为15～20μm。[注意：对于医嘱再次深切片(特别是在原切片中发现了有意义病变而进行的深切片)，应尽量少修块，以尽量好地获得有关病变的连续性。](7)调节切片厚度调节器(一般为4~6μm)，进行切片，切出的蜡片应连续成带，完整无缺，厚度适宜(3～5μm)、均匀，无刀痕、颤痕、皱折、开裂、缺损、松解等。(8)以专用小镊子轻轻夹取完整、无刀痕、厚薄均匀的蜡片，放入伸展器的温水中(45℃左右)，使切片全面展开。[注意：必须水温适宜、洁净(尤其是水面);每切完一个蜡块后，必须认真清理水面，不得遗留其它病例的组织碎片，以免污染。](9)将蜡片附贴于涂有蛋白甘油或经3-氨丙基-三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，APES)处理过的载玻片上(HE染色时酌情使用，可省略，必要时)。蜡片应置放在载玻片右(或左)2/3处的中央，留出载玻片左(或右)1/3的位置用于贴附标签。蜡片与载玻片之间无气泡。(10)必须立即在置放了蜡片的载玻片一端(待贴标签的一端)，用优质记号笔或刻号笔准确、清楚标记其相应的病理号(包括亚号)。[注意：必须确保载玻片上的病理号与相关组织石蜡包埋块的病理号完全一致，不得错写或漏写病理号。](11)将置放了蜡片的载玻片呈45℃角斜置片刻;待载玻片上的水分流下后，将其置于烤箱中烘烤(60～62℃，30～60min)，然后即可进行染色。(12)注意事项①组织块固定、脱水、透明和浸蜡的质量直接影响切片制备。切片过程中遇到的困难首先应注意从切片前的上述各环节中寻找原因。②切片机的质量是制备优质切片的重要前提。要使用质量好的切片机，规范地切片，精心维护切片机。③经由内窥镜、穿刺等获取的细小组织，应间断性连续切片多面(一般至少制备6张蜡片，必要时制备更多张)。需作特殊染色、免疫组化染色等的病例，可预制蜡片备用。④切片人员应细心操作，防范被切片刀具割伤。㈣常规切片的自动组织处理机操作(步骤次序和各步骤的持续时间，总计需要14小时)1.乙醇-甲醛(AF)固定液2×60min2.95%乙醇Ⅰ2×60min3.95%乙醇Ⅱ2×60min4.无水乙醇Ⅰ60min5.无水乙醇Ⅱ60min6.二甲苯Ⅰ30min7.二甲苯Ⅱ30min8.石蜡Ⅰ30min9.石蜡Ⅱ60min10.石蜡Ⅲ90min11.包埋(1)手工常规包埋：参见上述的“㈠手工操作”项。(2)用组织包埋机时，按有关厂商说明书的规定操作。12.切片：参见上述的“㈠手工操作”项。14.注意事项(1)必须按有关说明书的规定，使用和维护自动组织处理机、包埋机、磨刀机、封盖玻片机等仪器等。(2)要严防因停电、机械故障等造成的组织块损坏。一旦发生此类事故，必须及时向科主任报告，尽快采取应急措施妥善处置。(3)使用自动组织处理机时：①合理设定的运行时间(充分利用夜间)。②固定、脱水的环境温度不得>30℃。③乙醇、二甲苯和熔蜡的容积，要大于组织块总体积的5～10倍以上，并应经常过滤，保持清洁;应经常检查试剂的浓度，及时更新。④对于多量组织块，可按其大小分批进行处理;小块组织可适当缩短处理时间。三、快速石蜡包埋组织切片的制备㈠煮沸固定切片法1.固定：切取大小适宜(厚度<2mm)的组织块，尽快置入装有5~8ml10%中性4%甲醛的试管中煮沸1min，然后已入冷水中。2.脱水(1)将已经煮沸固定的组织块取出，用刀片将其厚度修切至<1.5mm，随即置入盛有5~8ml丙酮的试管中，煮沸2min，然后将丙酮倾弃。(2)再向该试管中重新加入5~8ml丙酮并煮沸2min。如此重复3~4次。3.浸蜡：将已经丙酮脱水的组织块由试管中取出，用吸水纸去除其表面液体，随即置入75~80℃熔化的石蜡中，待组织块下沉、不再出现气泡时(约需30s)，即可包埋。4.包埋、切片和染色。(1)用热镊子将预制的蜡块表面熔化，埋入已经浸蜡的组织块。(2)待埋入组织块的蜡块表面凝固后，即用载玻片轻压蜡块表面片刻，使蜡块表面平整。(3)将蜡块置入冰水中，使其变硬。(4)迅速切片，裱片后用吸水纸去除载玻片上的水分。(5)将载玻片用火焰烘干(勿距火焰太近)。(6)迅速进行HE染色。5.注意事项(1)为了尽量缩短制片时间，必须预先作好有关准备工作，备齐取材用具、试管、固定液、丙酮、酒精灯、火柴(或其他引火器)、包埋用蜡块、载玻片和染色试剂等，放在固定部位待用。(2)全部制片过程一般在20~25min内完成。(3)制片后剩余组织块应作常规石蜡包埋切片染色，进一步诊断。(4)含脂肪较多的组织，须经多次丙酮处理。(5)用于组织固定、脱水、透明的试剂和浸蜡用的石蜡应及时过滤、更换。(6)丙酮、乙醇、二甲苯等为易燃物，进行上述各项流程时，2m距离内不得存在明火。加温脱水和浸蜡过程必须应用隔水温箱，不得使用干烤箱操作。㈡超声波快速处理仪石蜡切片法(参照有关厂商的说明书操作)。四、冷冻组织切片的制备㈠应用恒冷箱切片机制备切片：是目前最适用方法。恒冷箱切片机种类较多，应严格按有关厂商的说明书操作。用于切片的标本必须未曾固定。㈡应用开放式冷冻切片机制备切片1.二氧化碳制冷切片(1)将组织块放在冷冻台上，滴加OCT或羟甲基纤维素液于组织块周围(将组织块包埋)，使固定在切片机上的切片刀接近组织块表面。(2)间断开放液态二氧化碳桶的开关，喷冻组织块和切片刀，使组织块冻结和切片刀制冷。(3)迅速移动切片刀进行切片：先将组织块修平，然后调节厚度至8~12μm处进行切片。(4)用毛笔将切片展开，贴附于载玻片上，稍干后，置于冷冻切片固定液中固定1min，随即进行HE染色。也可用毛笔将切片托入水中，再用玻璃弯针将切片移至染色皿中进行染色。(5)组织块也可先在4%中性甲醛中煮沸固定1min，水洗后再行冷冻切片。2.半导体致冷切片(1)切片刀与持刀器之间要间隔一层云母片或硬纸片。将冷刀致冷器粘在刀面上。(2)将组织冷冻台安装在半导体切片机上。(3)将冷冻台和切片刀致冷器上的导线连接在控制台直流电源上(注意：正负电极不可接反)。(4)连接致冷器的冷却水管并开始放水，然后开启电源;冷却水管中的水流量不宜过大，在使用过程不得断水。(5)调整冷冻温度调节器，至切片刀和冷冻台呈现霜冻。(6)将新鲜组织块或已固定的组织放在冷冻台中央，滴加水或OCT，或用水调成糊状的甲基纤维素于组织块周围(将组织块包埋)。(7)待组织块冷冻适当后，进行切片。(8)对于未经固定的新鲜组织，用毛笔将制作满意的切片展平，立即裱贴于盖玻片或载玻片上，待冷冻的切片刚要融化时，立即将其置于冷冻切片固定液中固定1min。对于已经固定的组织块，可用毛笔将制作满意的切片托入水中，再用玻璃弯针将切片移至染色皿中进行染色。(9)切片完毕后，先关闭电源，再关闭冷却水，待冰霜融化后擦干机器，加罩。3.甲醇致冷切片(按有关厂商的仪器说明书操作)。4.氯乙烷致冷切片(1)将新鲜的或已经固定的组织块置于支持器中央，加少许水或OCT。(2)连续喷射氯乙烷于组织块上，待组织块冻结后，改为间歇喷射，使冻结适度，立即切片。使用氯乙烷时应注意防火、防爆。(3)进行组织切片的裱贴、固定和染色(与上述方法相同)。㈢注意事项1.制作冷冻切片所需的试剂和设备等应处于随时可供使用状态。2.切取的组织块大小适宜(厚度<2mm)，并尽快置于冷冻组织切片机上制备切片。3.调节冷冻程度，试切合适时便迅速切片。冷冻不足无法切片，冷冻过度切片易碎。4.冷冻切片固定液(1)乙醚-乙醇液无水乙醚1份95%乙醇1份(2)乙醇-冰醋酸液95%乙醇100ml冰醋酸3～5滴五、脱钙方法骨和其他钙化组织，通常需要脱去钙盐后进行切片。骨组织脱钙前需先行固定。㈠常规脱钙法：1.将骨组织锯成薄片(约1×1×0.3cm)。2.在AF中或4%中性甲醛中固定6～12h。3.将骨片置于5%硝酸(急需时可置于37℃温箱)中脱钙，至用针轻刺可入时为止，约需12~24h(小块骨组织脱钙仅需2~3h)，其间可更新脱钙液2～3次。4.流水冲洗1~2h。5.移入5%甲明矾液，2~4h。6.流水冲洗2~3h。7.按常规脱水。8.石蜡包埋。㈡电解脱钙法：将骨片置于装有8%硝酸和10%甲酸混合液的电泳槽(有盖的方形玻璃标本缸或烧杯)内的阳极处，6V直流电源下持续电解30min~3h，至用针轻刺可入时为止。㈢骨髓组织脱钙：可浸泡于苦味酸乙醇饱和液(占85%)、甲醛(占10%)和冰醋酸(占5%)的混合液中(同时进行固定和脱钙)。㈣注意事项1.骨片等脱钙组织的厚度适宜。2.脱钙组织与脱钙液的体积比>1:30。3.脱钙过程中应不时摇动，多次更换脱钙液。4.脱钙时间不可过长。5.微波处理可加速脱钙过程。6.脱钙后的组织必须用流水充分冲洗。7.用于包埋的石蜡硬度适中(不要过软或过硬)。六、苏木素-伊红(HE)染色HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。㈠染色程序1.石蜡切片HE染色(常规HE染色)(1)二甲苯Ⅰ5～10min(2)二甲苯Ⅱ5～10min(3)无水乙醇Ⅰ1～3min(4)无水乙醇Ⅱ1～3min(5)95%乙醇Ⅰ1～3min(6)95%乙醇Ⅱ1～3min(7)80%乙醇1min(8)蒸馏水1min(9)苏木素液染色5～10min(10)流水洗去苏木素液1min(11)1%盐酸-乙醇1～3s(12)稍水洗1～2s(13)返蓝(用温水或1%氨水等)5～10s(14)流水冲洗1～2min(15)蒸馏水洗1～2min(16)0.5%伊红液染色1～3min(17)蒸馏水稍洗1～2s(18)80%乙醇1～2s(19)95%乙醇Ⅰ2～3min(20)95%乙醇Ⅱ2～3min(21)无水乙醇Ⅰ3～5min(22)无水乙醇Ⅱ3～5min(23)石炭酸-二甲苯3～5min(24)二甲苯Ⅰ3～5min(25)二甲苯Ⅱ3～5min(26)二甲苯Ⅲ3～5min(27)中性树胶封固注：①(12)和(13)项可省去，但(14)的冲水时间需延长至10～15min(细胞核显示更清晰)。②(23)项可用无水乙醇代替;北方地区可省略。2.冰冻切片HE染色(1)冰冻切片固定10～30s(2)稍水洗1～2s(3)苏木素液染色(60℃)30～60s(4)流水洗去苏木素液5～10s(5)1%盐酸-乙醇1～3s(6)稍水洗1～2min(7)返蓝(用温水或1%氨水等)5～10s(8)流水冲洗15～30s(9)0.5%伊红液染色1～2min(10)蒸馏水稍洗1～2min(11)80%乙醇1～2min(12)95%乙醇1～2min(13)无水乙醇Ⅰ1～2min(14)无水乙醇Ⅱ1～2min(15)石炭酸-二甲苯2～3min(16)二甲苯Ⅰ2～3min(17)二甲苯Ⅱ2～3min(18)中性树胶封固注：①(7)和(8)项可省去，但(9)的冲水时间需延长至10～15min(细胞核显示更清晰)。②(15)项可用无水乙醇代替;北方地区可省略。㈡染色结果：细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。㈢染色注意事项1.切片染色前，应彻底脱蜡。2.用含有升汞液体固定的组织，其切片染色前应先脱去汞盐：(1)石蜡切片脱蜡至水洗(2)Lugol液20min(3)流水冲洗5min(4)95%乙醇10min(5)水洗1min(6)5%次亚硫酸钠水溶液5min(7)流水冲洗5min(8)显微镜观察除汞满意后，转入HE染色3.脱除福尔马林色素(必要时)：(1)石蜡切片脱蜡至水洗(2)1%NaOH(1ml)与80%乙醇(99ml)混合液10min(3)流水冲洗5min(4)转入HE染色4.严格执行HE染色流程，用显微镜控制细胞核的苏木素染色质量。HE染片应着色鲜艳，红、蓝分明，对比清晰。5.载玻片自二甲苯中取出后，应立即用洁净、光亮的盖玻片和稠度适宜的中性树胶湿封载玻片。封盖处内无气泡，外无溢胶。封片时必须进行操作人员和局部环境的二甲苯污染防护。不应将组织切片烤干或风干后再行封片。6.必须在载玻片的一端牢贴标签。标签上应印有病理科所在的医院名称。标签上应清楚显示有关的病理号及其亚号;标签上的病理号应准确无误，无涂改。7.制片完成后，技术人员应对切片与其相应的病理学检查记录单或取材工作记录单认真进行核对;确认无误后，将制备好的切片连同相关的活检申请单/活检记录单以及取材工作单等一并移交给有关的病理医师;交接双方经核对无误后，办理移交签字手续。8.石蜡切片-HE染色的优良率(甲、乙级切片所占的比率)应≥85%。石蜡切片-HE染色质量的基本标准列于附表。9.制片工作一般应在取材后2个工作日内完成(不含进行脱钙、脱脂等需要特殊处理的标本)。10.制片过程出现意外情况时，技术室人员应及时向病理医师和科主任报告，设法予以补救。附表常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准优质标准满分质量缺陷减分⒈组织切面完整，10①组织稍不完整：减1～3分②不完整：减4～10分内镜咬检、穿刺标本切面数10③未达到规定面数：减5分⒉切片薄(3～5μm)，厚薄均匀10①切片厚(细胞重叠)，影响诊断：减6～10分;②厚薄不均匀：减3～5分⒊切片无刀痕、裂隙、颤痕10①刀痕、裂隙、颤痕，尚不影响诊断：减2分②有刀痕、裂隙、颤痕，影响诊断：减5分⒋切片平坦，无皱褶、折叠10①有皱褶或折叠，尚不影响诊断：各减2分②有皱褶折或折叠，影响诊断：各减5分⒌切片无污染10有污染：减10分⒍无气泡(切片与载玻片间/10①有气泡：减3分盖片与切片、载玻片间)，②胶液外溢：减3分盖片周围无胶液外溢⒎透明度好10①透明度差：减1～3分②组织结构模糊：减5～7分⒏细胞核与细胞浆染色对比清晰10①细胞核着色灰淡或过蓝：减5分②红(细胞浆)与蓝(细胞核)对比不清晰：减5分⒐切片无松散，裱贴位置适当10①切片松散：减5分②切片裱贴位置不当：减5分⒑切片整洁，①切片不整洁：减3分标签端正粘牢，编号清晰10②标签粘贴不牢：减3分③编号不清晰：减4分合计100切片质量分级标准：①甲级片：≥90分(优)②乙级片：75～89分(良)③丙级片：60～74分(基本合格)④丁级片：≤59分(不合格)㈣HE染色试剂的配制1.苏木素染液(1)Harri苏木素染液苏木素1g无水乙醇10ml硫酸铝钾20g蒸馏水200ml氧化汞0.5g冰醋酸8ml先用无水乙醇溶解苏木素，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾;然后将该两液合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌溶液至深紫色，随即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。使用前加入冰醋酸并混匀、过滤。(2)Gill改良苏木素液苏木素2g无水乙醇250ml硫酸铝钾17g蒸馏水750ml碘酸钠0.2g冰醋酸20ml先用无水乙醇溶解苏木素，用蒸馏水溶解硫酸铝钾;然后将该两液混合，再依次加入碘酸钠和冰醋酸。使用前过滤。(3)Mayer改良苏木素液A液：苏木素2g无水乙醇40mlB液：硫酸铝钾100g蒸馏水600ml将苏木素溶于无水乙醇中(A液);稍加热，使硫酸铝钾溶于蒸馏水中(B液)。将A液与B液混合后煮沸2min，再用蒸馏水补足至600ml，加入400mg碘化钠充分混匀。染液呈紫红色。2.盐酸-乙醇分化液浓盐酸1ml70%乙醇99ml3.伊红液(1)0.25～0.5%伊红Y水溶液伊红Y0.25～0.5g蒸馏水100ml冰醋酸1滴(2)0.5%伊红Y-氯化钙水溶液伊红Y0.5g蒸馏水100ml无水氯化钙0.5g(3)0.25～0.5%伊红Y-乙醇溶液。伊红Y0.25~0.5g80%乙醇100ml4.石炭酸-二甲苯混合液石炭酸1份二甲苯3份第二节细胞学诊断检材的制备技术一、细胞涂片、组织印片和压片的制备(一)涂片质量的基本要求1.将检材涂布于载玻片的右(或左)2/3处，另1/3部位粘贴标签。2.单向涂布检材，避免细胞变形。3.均匀涂布检材，涂片厚薄适当。4.红细胞过多的涂片，可酌情进行溶解红细胞处理。(二)涂片方法1.涂抹法：用棉签或针头将标本单向、均匀地涂抹于载玻片上。2.拉片法：将一滴检材置于一张载玻片上，再用另一张载玻片叠加其上并予轻压，再将该两张载玻片朝反向拉动，从而获得两张涂片。3.推片法：将一滴检液置于载玻片的右端，再用另一张窄边光滑的载玻片作为推片，并以与滴液载玻片成40°夹角、自右向左匀力推动检液，形成涂片。(三)痰涂片的制作1.送检的痰液应是由肺内咳出，最好是清晨空腹时自肺内深咳出的痰液。2.核查无误的收验痰液，应立即制作涂片(通常为2～3张)。3.用细签或无钩镊子挑取痰液置于载玻片上，并左右往复薄涂，随即投入固定液中。4.痰液中呈现下列性状的成分可能含有癌细胞，应注意挑取制作涂片：①血丝;②灰白色痰丝(形如白色细线，微细螺旋状，牵引时可伸长);③透明痰液(可拉成较长细丝)。[及时在细胞学检查申请单上记录痰液性状]5.检查痰液中的肿瘤细胞，一般应连续送检3次。(四)黏膜、皮肤表面刮取(刷取、拉取)物和分泌物的涂片的制作1.阴道排出物、子宫颈刮取物涂片：通常由妇产科医师将已制作、固定后的涂片送交病理科检查。[注意由子宫颈外口上皮移行带刮取细胞涂片]2.支气管镜、胃镜等内腔镜的黏膜刷取物涂片(黏膜刷片)：刷片通常由内腔镜医师制作、固定后送交病理科检查。3.食管、胃拉网涂片：由食管拉出的套网气囊适量放气后，将气囊套网在载玻片滚动涂片，尤应将套囊上血丝、灰白色物制作涂片;涂片通常由有关临床医师将已制作、固定后的刷片送交病理科检查。套网中的小块组织可用来制作石蜡包埋切片。4.眼、耳、鼻、咽、口腔、皮肤等处病变(溃疡性病变等)的分泌物涂片。(五)液体涂片的制作液体标本(检材)包括乳头溢液、胸水、腹水、尿液、胃液、脑脊液、穿刺液、冲洗液、灌注液等。除乳头溢液外，其他液体检材一般均应先行离心(2000r/min，10～20min)后，取其沉淀物制作涂片;液体检材也可用细胞涂片离心机(cytospin)直接制作细胞涂片。制作好的涂片应立即固定和染色。[及时在细胞学检查申请单上记录液体标本的性状和数量]液体标本的离心沉淀物较多时，将制作涂片后剩余的沉淀物固定于4%中性甲醛中1h，然后用檫镜纸或绸布将其包裹，制作石蜡包埋切片。1.乳头溢液：直接滴于载玻片上制作涂片。(1)患者乳腺触及肿物时：用手指自肿物远方沿乳腺导管引流方向轻力按模挤压，获取溢液，宜取中段溢液和血性溢液涂片。(2)患者乳腺未触及肿物时：可自乳晕周围向乳腺外周轻力按模挤压，获取溢液。2.胸水和腹水(1)由患者体内抽取的胸水或腹水应尽快送交病理科验收，检液量以200～500ml为宜。因故(例如远途)延时送达时，需在标本中加入40%的甲醛(加入量为送检胸水、腹水量的1/5)，或加入等量的50%乙醇-生理盐水。(2)胸水、腹水的离心：采取容器底部的液体10ml(包括可能存在的沉淀物)，移入离心管内进行离心。(3)离心后，倾去全部上清液，将离心管底部含有沉淀物的液体摇匀并用吸管吸出适量，滴注于载玻片上，制作涂片。3.尿液(1)制作方法同胸、腹水。(2)尿液含有胶状物时，应先将其除去。清除方法：用0.5ml/L氢氧化钠调节尿液Ph至6.0;离心后，倾去上清液，再向沉淀物中加入95%乙醇5～10ml/L(固定细胞)，静置5min后加入蒸馏水并轻摇(溶去胶状物);再次离心后，取沉淀物制作涂片。检查尿液中的肿瘤细胞，一般应连续送检3次。4.胃液、胃冲洗液：制作方法同胸、腹水。5.脑脊液(1)制作方法同胸、腹水。(2)脑脊液内细胞一般较少，可用微孔滤膜过滤法、沉淀法或纤维捕捉法收集细胞，制作涂片。6.冲洗液、灌洗液、穿刺液涂片的制作：参见上述的胸水、腹水项。二、肿物细针穿刺物涂片的制备(一)实施细针穿刺术前的准备工作1.实施细针穿刺术的病理医师应先了解患者临床情况，向患者和/或患者授权人说明实施穿刺术的意义、局限性和其他相关问题等，取得患者和/或患方的知情和理解，并签署由各医院制订的《申请实施细针穿刺术细胞病理学诊断患方知情同意书》。2.合格的手术操作环境。3.必备的适用手术器械和其他相关设施。(二)肿物穿刺术的操作要点：1.确认肿物部位并估计其大小、与皮表距离和质地(实/囊性、硬度等)，以指导穿刺的方向、深度和用力程度。2.必须严格实行无菌操作。3.根据肿物大小及其血供情况选择适用型号的穿刺用针头。穿刺用针头的外径为0.6～0.9mm，安置在2ml或10ml的一次性空注射器上。4.针吸法穿刺术操作要点(1)进行穿刺前，先将安装了穿刺用针头的空注射器管芯外拉2cm;然后，用手固定肿物，将安装在空注射器上的穿刺用针头刺入肿物(注射器内无空气)。(2)迅速上下提插注射器管芯10～20次(其间变换针头方向3～4次)，遂使肿物不同部位的多较内容吸进入针头和注射器内。(3)将注射器与针头分离(管内负压因而解除);随后，再将该注射器与仍插于肿物内的针头相接，拔出针头，穿刺结束。(4)迅速推动注射器的管芯，尽快地将位于穿刺针头内的少量吸出物排射在2～3张清洁的载玻片上，进行涂片。5.涂片方法：用针头将载玻片上的吸出物轻轻均匀拨开，或用推片法朝一个方向展开(不可双向往返推移)。6.吸出物过少时，可用向离心管内冲洗穿刺针头;再将冲洗液离心，然后取其沉淀物涂片[参见上述一(五)项“液体涂片的制作”]。7.吸出物较多时，可适量50%乙醇-生理盐水液将涂片后注射器和针头内剩余的吸出物冲洗至离心管中，离心后，取其沉淀物制作常规石蜡包埋切片。8.吸出物中含有细小组织块时，应将其制作常规石蜡包埋切片。9.内脏肿物穿刺时，必须在影象学检查的引导下用较长细针进行穿刺。10.穿刺操作完成后，即在细胞病理学检查单上书写穿刺记录。三、组织印片、压片的制备(一)组织印片：1.用锋利刀片剖开刚切取的新鲜肿瘤组织或淋巴结等，然后用清洁载玻片轻压于组织剖面处，将组织表面的细胞成分印在玻片上。用稍微加温的载玻片制备印片时，可印得较多细胞。2.制作淋巴结印片前，应先用滤纸吸去淋巴结切面上的血液、组织液。(二)压片：1.选取微小薄片组织平铺于一张载玻片上，再用另一张载玻片叠加其上并予轻压。2.脑组织质软，易于制作压片;稍硬的组织需切成细碎薄片制作压片。四、涂片的固定(一)用于HE染色和巴氏染色的涂片必须湿固定，即涂片后立即进行固定。乳头溢液涂片和液体标本离心沉淀物涂片，应待涂膜潮干(即周膜稍干而其中央区域未干)时进行固定。用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆萨染色和免疫细胞化学染色的涂片，必须干固定，即待涂片稍干后再进行固定。(二)固定液1.乙醇-冰醋酸液：95%乙醇∶冰醋酸=99∶1。常用。2.乙醇-乙醚液：95%乙醇49.5ml,乙醚49.5ml,冰醋酸1ml。较常用。3.甲醇：滴加在干燥涂片上，用于瑞氏染色、May-Grünwald姬姆萨染色和免疫细胞化学染色。4.丙酮：适用于酶类染色。5.Carnoy液：由无水乙醇、氯仿、冰醋酸按6:3:1比例混成，适用于显示核酸、糖原、黏液染色。涂片在Carnoy液固定3～5min后，应移入95%乙醇中继续固定。6.对于液体标本的离心沉淀物、食管拉网获取的小块组织或吸出物中的细小组织块等，固定于4%中性甲醛液中1h，然后制作常规石蜡包埋切片。(三)固定方法1.浸入法：(1)将稍为干燥(不能完全干燥)的涂片直接浸泡于固定液内至少15～30min。(2)因细胞容易脱落，宜以一个盛有固定液的容器只固定一例标本的涂片;一个容器固定多例涂片时，有可能造成的肿瘤细胞交叉污染。(3)必要时可将标本涂在硅化载玻片上，以防脱落。(4)固定液重复使用时，应先用滤纸过滤。(5)95%乙醇固定液多次重复使用时，需测定其浓度比重，乙醇浓度低于90%时应予弃用。2.滴加法：将固定液滴加于平放的干燥涂片上，应避免因固定液挥发造成沉淀。(四)固定后未染色涂片的保存或邮寄：涂片固定15min后取出，立即滴加数滴甘油于涂膜上。对该涂片进行染色前，应先将其置于95%乙醇中溶去甘油。五、涂片的染色最常用于细胞病理学涂片检查的是苏木素-伊红(HE)染色和巴氏染色。一些特殊染色、组织化学染色和免疫组织化学染色也用于细胞病理学的涂片检查(参见第4章第一、二节)。(一)苏木素-伊红(HE)染色(参见本章第一节的“六”项)。(二)巴氏(Papanicolaou)染色巴氏染色时，细胞透明度好，细胞结构清晰，色彩丰富而鲜艳，主要用于妇科细胞学涂片、痰涂片和富含鳞状上皮细胞的涂片检查。1.试剂配制(1)Harri苏木素液(参见本章第一节的“六”项)(2)盐酸-乙醇液浓盐酸1ml70%乙醇99ml(3)橙黄G6液橙黄G60.5g蒸馏水5ml无水乙醇95ml磷钨酸0.015g先将橙黄G溶于蒸馏水中，再加入无水乙醇，然后加入磷钨酸。(4)EA36染液①EA36储备液A液：亮绿0.5g，溶于5ml蒸馏水中，溶解后加入无水乙醇至100ml。B液：伊红0.5g，溶于5ml蒸馏水中，溶解后加入无水乙醇至100ml。C液：俾士麦棕0.5g，溶于5ml蒸馏水中，溶解后加入无水乙醇至100ml。②EA36工作液EA36储备液的A液45mlEA36储备液的B液45mlEA36储备液的C液10ml磷钨酸0.2g碳酸锂饱和水溶液1滴2.染色程序(1)将已经固定的涂片置于80%乙醇中2min。(2)蒸馏水洗2min。(3)苏木素液染核10～12min，自来水洗。(4)盐酸-乙醇液分化约20～30s，至涂片呈淡橙红色。(5)流水冲洗10～15min，蒸馏水洗。(6)依次用80%、95%乙醇脱水，各2min。(7)橙黄G6液染色3～5min。(8)95%乙醇洗2～3次，洗去多余染液。(9)EA36工作液染色3～5min。(10)95%乙醇洗2～3次，洗去多余染液。(11)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。3.染色结果：细胞核呈深蓝色，核仁呈红色;不同分化类型的鳞状上皮细胞，其胞浆颜色各异：角化细胞呈粉红色，不全角化细胞呈橙黄色，角化前细胞呈淡蓝或淡绿色;红细胞呈橙红或鲜红色，白细胞的胞浆呈淡蓝绿色;粘液呈淡蓝或粉红色。(三)瑞氏(Wright)染色瑞氏染色一般用于血液涂片，也可用于检查肿瘤细胞。1.试剂配制(1)瑞氏染液瑞氏染料1g甲醇600ml将瑞氏染料放入研钵内，加入适量甲醇与之混合研磨，使染料逐渐溶解。将溶解的染液倾入另一玻璃瓶内，然后再加入适量甲醇继续研磨;未溶解的染料如此反复多次，直至染料完全溶解、甲醇用完为止。染液避光保存备用。(2)磷酸盐缓冲液无水磷酸氢二钠6.5g磷酸二氢钠4g蒸馏水1000mlpH：6.5～7.02.染色程序(1)涂片自然干燥。(2)滴加瑞氏液染色1min。(2)滴加等量的磷酸缓冲液，轻轻摇荡玻片或用洗耳胶球在玻片上轻轻吹气，使两液体混合均匀，持续10～15min。(4)流水洗去染液。(5)涂片风干后，二甲苯透明，中性树胶封片。3.染色结果：胞核呈紫红色，胞浆呈紫蓝色，粘液呈粉红色或淡蓝色。(四)May-Grünwald-姬姆萨(Giemsa)染色May-Grünwald-姬姆萨染色适用于造血系统的细胞涂片和鉴别恶型淋巴瘤的类型。May-Grünwald原液和姬姆萨原液配制繁琐，可直接购买。1.试剂配制(1)May-Grünwald工作液May-Grünwald原液1份蒸馏水6～10份使用前配制。(2)姬姆萨工作液姬姆萨原液1份蒸馏水6～10份使用前配制。2.染色程序(1)涂片自然干燥，蒸馏水洗1～2min。(2)May-Grünwald工作液染15～30min。(3)自来水冲洗，洗去载玻片上的染液，蒸馏水稍洗。(4)姬姆萨工作液染15～30min。(5)自来水冲洗，洗去载玻片上的染液。(6)涂片风干后，二甲苯透明，中性树胶封片。3.染色结果：胞核呈紫红色，胞浆和核仁呈蓝紫色。(五)Rakoff染色Rakoff染色用于阴道细胞学涂片快速测定雌激素水平。1.试剂配制(1)5%淡绿水溶液83ml(2)1%伊红水溶液17ml将两液混合后使用。2.染色程序(1)用细胞刷沿阴道侧壁刷取黏膜鳞状上皮细胞，放入装有1~2ml生理盐水的试管内。(2)在试管内滴入3滴Rakoff染液，用细胞刷在染液中轻摇混合。(3)将1~2滴混合液滴于载玻片上，制成涂片。(4)待涂片干燥后，用中性树胶封片。染色结果：鳞状上皮细胞的嗜酸性和嗜碱性胞浆区分明显。角化前细胞的核呈网状，角化细胞的固缩核呈基本不着色的空泡状。(六)猩红-固绿染色猩红-固绿染色用于显示性染色体。1.试剂配制(1)猩红染液水溶性比布里西猩红1.0g磷钨酸0.3g冰醋酸5.0ml50%酒精100ml(2)固绿染液:固绿0.5g磷钼酸0.3g磷钨酸0.3g冰醋酸5.0ml50%乙醇100ml2.染色步骤(1)涂片经95%乙醇固定后，置于70%乙醇中2min。(2)猩红染液中5min。(3)50%乙醇中漂清多余染液。(4)固绿染液中分化2~5h。每小时在显微镜下观察胞浆和网状核膜是否呈现绿色;如果绿色满意，立即取出涂片(一般约需4h)。固缩核呈鲜红色。(5)50%乙醇中5min。(6)依次置于70%、95%和无水乙醇中各2min。(7)置于二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明，各2min。(8)中性树胶封片。染色结果：胞核呈淡绿色;性染色质呈粉红色、V字形或贴着于细胞膜呈三角形。在性染色质周围可见空泡。(七)Fouchet染色Fouchet染色用于显示胆色素。1.染液配制Fouchet染液A液：25%三氯醋酸水溶液B液：10%三氯化铁水溶液A、B液皆小量新鲜配制为宜。使用时，取A、B液各30ml混匀(当天使用)。2.染色步骤(1)涂片经95%酒精固定后，置于蒸镏水中漂洗。(2)Fouchet液中染5min。(3)蒸镏水Ⅰ、Ⅱ中各1min。(4)苦味品红溶液中染5min。(5)95%乙醇Ⅰ、Ⅱ中漂洗。(6)无水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脱水。(7)二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，中性树胶封片。3.染色结果：胆色素呈橄榄绿色，胶原纤维呈红色，涂片背景呈黄色。(八)硫酸亚铁染色硫酸亚铁染色用于显示黑色素。1.试剂配制(1)2.5%硫酸亚铁水溶液(2)铁氰化钾醋酸液铁氰化钾1g蒸馏水99ml冰醋酸1ml(3)1%冰醋酸水溶液(4)核固红液[参见第4章第一节的八(三)项(爱先蓝法)]2.染色程序(1)涂片经95%酒精固定后，置于蒸镏水中漂洗1~2min。(2)2.5%硫酸亚铁溶液中1h。(3)蒸镏水Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中漂洗，各1min。(4)铁氰化钾醋酸液中30min。(5)1%冰醋酸液中1min。(6)蒸镏水漂洗。(7)核固红液中染1~2min。(8)蒸镏水漂洗。(9)依次95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。3.染色结果：黑色素呈深绿或深蓝色，涂片背景呈红色或粉红色。(九)快速硝酸银染色快速硝酸银染色用于显示卡氏肺囊虫和真菌。1.试剂配制(1)硝酸银乌洛托品常备液：3%乌洛托品溶液100ml与5%的硝酸银溶液5ml充分混合。工作液：常备液25ml、蒸镏水25ml与5%硼酸钠2ml充分混合。(2)固绿常备液：固绿0.2g充分溶解于0.2%冰醋酸液100ml中。工作液：常备液10ml与蒸镏水40ml混合(3)5%铬酸溶液1%亚硫酸氢钠溶液0.2%氯化金溶液2%硫代硫酸钠溶液2.染色步骤(1)涂片经95%乙醇固定后，置于蒸镏水中漂洗1min。(2)5%铬酸溶液(43℃水浴)中2min。(3)5%铬酸溶液(58℃水浴)中15min。(4)自来水漂洗。(5)1%亚硫酸氢钠溶液中30s。(6)自来水冲洗15s。(7)蒸镏水Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ漂洗各1min。(8)硝酸银工作液(43℃水浴)中2min。(9)硝酸银工作液(58℃水浴)中23min。(10)蒸镏水Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ漂洗。(11)0.2%氯化金溶液中30s。(12)蒸镏水Ⅰ、Ⅱ漂洗。(13)2%硫代硫酸钠溶液中1min。(14)自来水冲洗15s。(15)固绿工作液中染30s。(16)自来水冲洗15s。(17)蒸镏水Ⅰ、Ⅱ漂洗。(18)95%酒精、无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。3.染色结果：卡氏肺囊虫和真菌皆呈黑色，形状清晰;糖原和黏蛋白呈玫瑰色或灰色;涂片背景呈淡绿色。(十)高碘酸-无色品红(PAS)染色PAS染色用于显示多糖(糖原及黏蛋白等)。第三节病理学摄影技术一、概述(一)病理医师根据病理学诊断、教学和研究的需要确定病理学摄影的内容，进行客观、准确的图像记录。(二)病理学摄影的客体包括：①患者体表病征，②大体标本(手术切除和尸检标本的肉眼病变)，③组织学切片(光学显微镜下病变)，④超薄切片(透射电子显微镜下超微病变)，⑤冷冻蚀刻标本(扫描电子显微镜下超微病变)，⑥细胞培养标本，⑦细胞和分子细胞遗传学检测结果，⑧尸检过程，⑨动物实验标本和⑩文字、图像资料翻拍等。二、普通摄影(一)普通摄影是应用普通照相机拍摄客体的图像，包括患者体表病征，大体标本的肉眼病变，尸检过程，动物实验标本和文字、图像资料等。摄影时应注意病征或病变显示、光照、角度等，适度调节距离、光圈、速度。(二)患者体表病征摄影1.需征得患者或患方有关人员同意。2.应遮盖患者的面容和隐私部位。(三)大体标本摄影1.于标本下面铺垫色泽反差鲜明、协调的平整背景(纸或布)，并需置放标尺和相关标本的病理号，必要时添加箭头等符号标志指示重点部位。2.因照相机固定于翻拍机上，宜选用较慢的快门速度，以增加景深。(四)尸检过程摄影1.宜用28～135mm变焦镜头的135相机进行摄影。2.重要病变的原位摄影：应包括局部肉眼病变特征(“近拍”)及其与毗邻结构的解剖关系(“全景”)，突出重要病变，兼顾显示全貌。3.离体标本摄影[参见上文：“(二)大体标本摄影”](五)文字、图像资料翻拍1.应用翻拍机进行摄影。2.在翻拍相机的两侧一般至少安装2～4盏100W灯光，与照明直线呈45º角，以使光线均匀。摄影条件可用测光表确定。(六)底片的选择1.黑白摄影：扩印照片者，可用ASA100速度底片;制作幻灯片者可用ASA25～50速度底片。2.彩色摄影：(1)用日光型彩色底片摄影时，需用雷登80系列平衡滤色片把色温调到5600ºK状态;用灯光照射者，无需平衡滤色片。(2)用灯光型彩色底片在日光下摄影时，需用平衡滤色片把色温调到3200ºK状态。三、光学显微镜(光镜)摄影(一)光镜显微摄影是应用显微照相机拍摄通过光学显微镜放大40～1000倍的客体图像。(二)摄影用显微镜性能要求1.具有摄影目镜筒。2.能通过目镜筒对图像进行对焦。3.具有光镜选择移动杆。4.物镜具有分辨率良好平视场象。5.聚光镜具有孔径光阑和调节光轴中心的机构。6.具有视场光阑。7.光源亮度足够，电压可以调节。8.具有插入滤色镜的槽口。(三)显微摄影的基本装置1.具有自动输片机构的35mm照相机背。2.具有对不同光照条件进行光路调节的调节杆。3.具有能对不同标本面积进行自动测光的装置。4.具有与显微镜相连接的接圈、平场消色差物镜(Splan，Dplan)和聚光镜。5.具有显微摄影控制台。目前较常用的有日产OlympusPM-10及PM-20等显微摄影装置。常用参数项目包括：①快门按钮(EXPOSE)，②底片类型选择键(FORMAT)，③感光度旋钮(ASA/ISO)，④倒易律失效的补偿旋钮(RECIPROCITY)，⑤曝光增减旋钮(EXPOSUREADJ)，⑥快门速度调节旋钮(MODE/EXPOSURETIME)，⑦卷片按钮(OFF/MINDING)，⑧停片进片按钮(NOWINDING)，⑨自动曝光锁按钮(AEOCK)，⑩时间回忆按钮(TIMERECALL)。(四)显微摄影要点1.显微照相机必须安放稳定，具有一定防震性，室内光线应暗些以避免散射光进入目镜。2.选择适当的彩色或黑白底片装入照相机身(暗盒)。拍摄常规HE染色、特殊染色、免疫组化染色切片的病变，宜用感光度ASA为100的彩色或黑白底片;拍摄培养细胞和免疫荧光染色标本，宜用感光度ASA为400的彩色或黑白底片。3.调节照明和光照(1)打开电源，调节电压(约在9伏)。(2)视场光阑收缩到取景框边缘外。(3)孔径光阑调到物镜孔径数值的60%～80%，例如孔径为0.25的10×物镜，聚光镜上光阑应调到：0.25×60%～80%=0.15～0.2。(4)光通路调节①常规摄影：先将视野与照明合轴、再将聚光镜调中，使光线同时调到①观察目镜和②取景目镜的视野之中，以便于边观察边曝光摄影。如图像分布均匀，将曝光增减旋钮(EXPOSUREADJ)调至“1”处。②暗视野、荧光和偏振光摄影：将光线100%调到取景目镜的视野之中，用调焦镜观察视野中的标本图像，进行摄影。如图像分布不均匀，应将曝光增减旋钮调于0.25～4之间。4.调节和校准取景目镜于标准状态：旋转调焦镜镜筒上的圆环，使取景框中央的双十字线达到最清晰。5.将切片等标本放置在载物台上，先用观察目镜选定摄影图像，再用取景目镜调整摄影图像，并转动微调旋钮，同时使图像与取景框中的双十字线像达到最清晰。6.用彩色底片摄影时，必须用色温计调节色温：①将光通路100%到达色温计上(由调焦镜中看不到光线);②观察色温指示表，用平衡滤色镜(使用日光型底片时用雷登80系列)和灯光亮度将色温调至最佳色温点(日光型底片的色温点为5600K左右，灯光型底片的色温点定为3200K左右)7.用黑白底片摄影时，必须按下列对应关系选择滤色片以提高图像反差和清晰度：标本颜色红橙黄绿深蓝滤色镜蓝、绿蓝、绿蓝红、蓝深绿、橙8.检查光线可达到底片的位置，确定正确的曝光时间和进行曝光;或用自动摄影控制台上的按键曝光。9.记录图像的摄影日期、摄影编号、样品编号、放大倍数、内容、摄影条件和备注等。10.将已全部摄影过的底片退回底片暗盒内，取出底片并进行暗室冲洗等后期处理。四、电子显微镜(电镜)摄影(一)透射电镜摄影1.检查电镜工作状态，确认样本无漂移现象，选择好曝光条件。2.调节好灯丝像，消正像散。3.选择视野，确定放大倍数。4.调整物镜光阑：样品反差较强时，使用较大的物镜光阑孔，直至反差适中为止;反差小时，宜用较小的光阑孔。5.样本聚焦在低倍电镜(<1500倍)图像时，可采用摇摆聚焦法用肉眼定位;样品聚焦在高倍电镜(>1500倍)图像时，除用肉眼观察定位外，还需采用系列拍照法：于确定焦点后，用细调钮聚焦，增加物镜电流，每调动一级最小钮拍摄一张底片，总计拍摄4～5张，从中选择最佳底片。6.放平荧光屏，传送底片使之进入摄影位置。7.调定曝光亮度和速度，然后启动快门进行曝光;曝光结束后，将底片送入储存盒内。将底片全部摄影的储存盒取出，进行暗室冲洗等后期处理。8.用于透射电镜摄影的底片一般为色盲片(对红光不感光)，曝光时间为2～4s，ASA[中文?]为8～25s。(二)扫描电镜摄影1.检查电镜工作状态(1)加速电压强度的选择：取决于样品的性质、图像反差和放大倍率。高倍观察时一般需要较高的加速电压，低倍观察时需要较低的加速电压。(2)聚光镜电流的选择：在保证图像亮度和反差要求前提下，尽可能加大聚光镜电流，以提高照片分辨力，加大景深。(3)物镜光阑孔的选择：对于表面结构高低差异大的样本可用较小的光阑孔，以获较大景深;低倍镜下观察时，可选用较大光阑孔，以增加视野内的信号强度。(4)选择摄影扫描速度。(5)视野选择：与透射电镜相同。2.确定曝光时间。在扫描电镜照相机处于光关?F8或F11情况下，照片的曝光时间在50～100s之间。3.样品的聚焦程度主要依靠操作人员的肉眼观察。拍摄较低放大倍数(<1000倍)的图像，以调节粗聚焦钮为主;拍摄较高放大倍数(>1000倍)图像，应先调节粗聚焦钮，再调节细聚焦钮。4.图像消像散：①先调节X方向旋钮，消除X方向的像散;②再调节Y方向旋钮，消除Y方向的像散;③最后再调节细聚焦钮，直到图像最清晰为止。5.调节高度和反差：扫描电镜一般装有亮度和反差自动调节按钮，按动该钮即可得到反差适当的图像。6.拍摄：将照相机中的底片调至摄影位置，按动面板上的摄影快门钮，荧光屏上便由上而下自动扫描图像;扫描结束后，即完成一幅照片拍摄。7.底片选择：扫描电镜装有120或135照相机，故一般选择感光速度为ASA100的120或135胶卷，;装有Polaroid后背相机的扫描电镜，可进行一次成像。8.记录图像的摄影日期、摄影编号、样本编号、放大倍数、内容、摄影条件和备注等。五、暗室技术(一)暗室技术用于：①普通摄影、显微镜摄影和电镜摄影底片的冲洗，及其照片的洗印和放大;②幻灯片的制作等。(二)摄影底片的冲洗操作程序①于完全黑暗中取出全色底片(色盲片或电镜底片可在红灯下取出)→②将底片卷入螺旋形的槽内或显影架上→③清水湿润2min→④显影3～12min(20℃)→⑤定影10～20min(20℃)→⑥水洗30min→⑦凉干底片→⑧分类装入底片袋内，并做好记录。(三)试剂配制1.显影液：有多种配方，组成成分大同小异。下列的D‐11配方兼用于冲洗底片和照片的洗印和放大显影：水(50℃)500ml米吐尔1.0g无水亚硫酸钠75g对苯二酚9.0g无水碳酸钠25g溴化钾5g加水至1000ml冲洗电镜底片、色盲片和制做幻灯片、显影照片等，需要极强反差，可用以上配方的原液显影。普通摄影用的全色底片对反差要求不很高，可将原液用清水稀释成1:2～1:4的工作液。2.停影液水750ml28%醋酸48ml加水至1000ml3.定影液：较常用下列的F‐5酸性坚膜定影液水(50℃)600ml硫代硫酸钠240g无水亚硫酸钠15g28%醋酸48ml硼砂(结晶)7.5g硫酸铝钾15g加水至1000ml(四)照片的洗印和放大洗印和放大照片一般使用黑白放大相纸。这类相纸根据反差分为特软性、软性、中性、硬性和特硬性等5种，即0、1、2、3、4号相纸。较常用者为3号相纸。1.洗印：在印相箱中操作(一般装有自动定时曝光控制器)，主要用于制做透射电镜摄影的照片。已经曝光的像纸进入冲洗操作程序(同底片的冲洗程序)。2.放大：在放大机上操作，主要用于制做显微镜摄影的照片。(1)操作程序①放大镜头焦距的选择参见下表：底片规格135120120120120(16张)(12张)(10张)(8张)负片负片负片底片尺寸(mm×mm)24×3645×6060×5060×7060×9080×10590×120108×125镜头焦距(mm)507575～8080～9090～105135150175②装入底片：将底片的乳剂面向下，目测聚焦，使放大的图像结构清晰。③选择相纸：常用3号放大纸。④确定镜头光圈和曝光时间：对于正常反差的底片，将镜头光圈缩小到f/5.6至f/8之间，曝光时间控制在8～20s为宜。⑤将曝光后放大纸进入显影、定影程序中。六、数码摄影技术数码摄影通常包括：①拍摄、②下载(将所拍摄的照片由数码相机下载到电脑中)、③修饰(加工处理等后期制作)和④分享(将经过修饰的照片输出，例如打印等)4个步骤。(一)选择适当的照片质量要求数码相机的照片质量(解像度)分为①精细、②正常、③经济等档次。图像质量越好，每张照片占用的存储空间越大，在相同内存的情况下，解存储的照片数量越小。因此，在拍摄之前，应先根据需要，设定对于照片的质量要求，即设定压缩比。设定压缩比的原则是：①对照片质量要求越低，压缩比可越高;②只在监视器或电视机上观察图像而不打印时，压缩比可高些，可选择“正常”甚至“经济”档拍摄储存量小的图像。③需要打印照片(尤其欲获大幅彩色照片)时，压缩比越低越好，应选择“精细”档，最好选择不压缩的拍摄存储方式。(二)力求曝光准确1.数码相机的感光度最低为ISO60，最高为ISO6400，多在ISO100左右。ISO额定值较低时，解像度高、色调范围宽和反差低;ISO额定值较高时，解像度低、色调范围宽和反差高。2.选择感光度的原则：(1)检查光线是否足够。(2)尽量用较低的感光度拍摄。(3)曝光时间不要过长。照度低时，应尽量利用闪光拍摄。避免进行高感光度的长时间曝光。(4)曝光准确与否决定于对照片质量的要求。(三)注意对焦条件。(四)注意用光。(五)准确使用快门和光圈：宜用自动模式(Auto)拍摄。使用手动相机或将自动相机设置于手动模式时，需要随时进行调整。(六)正确设定白平衡：拍摄前设定自动白平衡，或是将白平衡调整设定在与拍摄光照条件一致的档上。(七)正确使用存储媒介：向数码相机内插入移动式存储卡时，一定要到位;从相机中取出存储卡时，要防止滑落到坚硬的物面上，以免不能读取照片的某些数据，甚至损坏存储卡。(八)勿距摄影客体过远：适当拍摄距离为5～15尺。拍摄小物体、文件等时，应启动数码相机的近摄功能。第五部分内窥镜技术操作规范一、上消化道内镜检查上消化道内镜能清晰地观察食管、胃、十二指肠壶腹至降段的粘膜形态及病变，如有病变可作活体组织病理学和细胞学检查以确定诊断。【适应证】1.有上消化道症状，包括上腹不适、胀、痛、烧心及反酸、吞咽不适、梗噎、嗳气、呃逆及不明原因食欲不振、体重下降、贫血等。2.上消化道钡餐造影检查不能确定病变或症状与钡餐检查结果不符者。3.原因不明的急(慢)性上消化道出血或须做内镜止血治疗者。4.须随访的病变，如溃疡病、萎缩性胃炎、癌前病变等。5.高危人群(食管癌、胃癌高发区)的普查。6.须做内镜治疗者。【禁忌证】1.食管、胃、十二指肠急性穿孔。2.严重心、肺、肾、脑功能不全及多脏器功能衰竭者。3.精神病及意识明显障碍不能合作者。【术前准备】1.器材内镜、光源主机、活检钳、细胞刷、必要的各种治疗器械、表面麻醉剂、各种急救药品(备用)以及内镜消毒设备。2.技术准备(1)了解病史、检查目的、特殊要求、其他检查情况、有无内镜检查禁忌证、有无药物过敏及急、慢性传染病等。(2)向患者讲明检查目的及配合检查须注意的事项。(3)术前禁食6～8h。已做钡餐检查者须待钡剂排空后再做胃镜检查。幽门梗阻患者应禁食2～3d，必要时术前洗胃。最好排空大小便。(4)咽部麻醉：检查前15min用含2%～4%利多卡因的胶浆(内有祛泡剂)或普鲁卡因喷雾或口含，有麻醉药过敏史者可不用麻醉。(5)不必常规应用镇静剂、解痉剂，对个别精神紧张或胃肠蠕动强者可在检查前15rnin肌内注射阿托品。患者条件许可时可行无痛胃镜检查。(6)术前常规检查各项器材是否齐备。【操作方法及程序】1.患者体位(1)患者取左侧卧位，头部略向前倾，双腿屈曲。(2)如患者有活动假牙宜取出，松解领口和裤带，轻轻咬住牙垫。2.插镜目前均使用单手法：术者面向患者，左手持内镜操纵部，右手在距离镜端20cm处持镜，使镜面对准患者舌根部，将镜端自牙垫中插至咽后壁，左手调节旋钮方向，使之顺利到达咽喉部。.嘱患者做吞咽动作，顺势轻柔地插人食管。切忌用暴力硬插。双手法(现已基本不用)3.胃镜检查次序插镜后，内镜直视下从食管上端开始循腔进镜，依次观察食管、贲门、胃体、胃窦、幽门、十二指肠。在退镜时依次从十二指肠、胃窦、胃角(低位翻转)、胃体、胃底贵门(高位翻转)、食管退出。依次顺序全面观察，应用旋转镜身，屈曲镜端等方法，观察上消化道全部，如戮膜色泽、光滑度、猫液、蠕动及内腔的形状等。如发现病变应确定其性质、范围及部位，并详细记录。并进行摄影、活检及细胞学取材。4.摄影现在摄影可通过计算机的视频采集程序来完成，只需踩下脚踏板即可完成病变部位的摄影工作。摄影应在观察完毕、活检前进行。摄影时应保持视野清楚，注意将病变.目标的特征从不同方向显示，并使病变得到可显示部位的标志背景的衬托。5.活体组织检查良、恶性局灶性病变应取4块以上的粘膜，立即放人4%甲醛液(10%福尔马林)固定，并贴标签避免错误，多个部位活检时，须在标签上注明活检部位。弥散性病变的粘膜应按食管、胃分瓶固定。须做快速尿素酶试验者应在幽门前区取1块以上标本，立即放入试剂盒内测试。6.细胞学取材应在活检后，检查结束前进行。插入细胞刷，在病变及其周围轻轻擦拭。刷后应将刷子退至活检孔前端，然后随内镜一同拔出，做2～4张涂片。涂片结束后立即放在95%乙醇中固定送检。检查结束前应抽吸胃内气体，同时退镜。【注意事项】1.检查结束后注意患者全身情况，尽管上消化道内镜检查是比较安全的，仍应仔细观察有无并发症发生。2.书写或电脑打印报告，并向患者解释检查结果。3.1h以后才允许进食，可进食温的流质至半流质。4.活体组织检查一般1周后取报告。【并发症】1.咽部感染咽部病变，可因咽部损伤继发感染，甚至发生咽部蜂窝织炎或咽后壁脓肿，应予休息及抗生素治疗。2.食管穿孔为严重甚至致死性并发症，尤其并发纵隔炎者，须抗生素治疗、手术缝合或引流治疗。3.胃穿孔不如食管穿孔严重，须抗生素及手术缝合治疗。4.出血因粘膜损伤或活检时取组织太深、撕拉过度所致。出血量不多时，多能自行停止，如出血过多，应内镜下止血。5.心血管意外可因咽喉迷走神经反射引起，有个别心搏停止病例。根据当时心脏情况，应予以相应的处理，包括吸氧、抗心律失常药物、复苏术等。6.颞下颌关节脱位患者因用力咬牙垫而恶心时，易发生颞下颌关节异常运动引起脱位，可采用手法复位。二、结肠镜检查结肠镜检查是诊断和治疗大肠疾病的安全、有效、可靠、简便的方法之一，不但可明确钡剂灌肠X线检查未能明确的病变，而且能取活检做病理检查，并对某些大肠疾病进行治疗。广泛开展此项检查，可提高早期大肠癌的发现率，还能对癌前期病变和大肠息肉及时治疗。【适应证】1.原因不明的下消化道出血;2.原因不明的慢性腹泻、便秘、腹痛、腹胀;3.钡剂灌肠发现有异常;4.不能排除大肠或末端回肠的肿物;5.原因不明的低位肠梗阻;6.某些炎症性肠病须做鉴别和确定累及范围及程度;7.大肠某些良性病变为除外恶性变;8.大肠息肉和癌诊断已明确，为了除外其他部位有无伴发性病变;9.行结肠镜下治疗;10.大肠某些疾病药物治疗的随访;11.大肠癌手术后，大肠息肉摘除后随访;12.大肠肿瘤的普查。【禁忌证】1.疑有大肠穿孔、腹膜炎;2.严重心、肺、肾、肝及精神疾病;3.多次开腹手术或有肠粘连者，应慎行结肠镜检查;4.妊娠期可能会导致流产或早产;5.大肠炎症性疾病急性活动期为相对禁忌证;6.高热、衰弱、严重腹痛、低血压者，最好待病情稳定后再行结肠镜检查;7.不合作者及肠道准备不充分者为相对禁忌证。【术前准备】.1.收集病史，介绍“患者须知”，争取患者配合;2.检查前3d少渣饮食，检查前1d流质饮食，检查日上午禁食。检查前晚泻药清肠或清洁灌肠。现在有更简便的清肠方法，可根据不同要求按说明书使用。3.准备好结肠镜、冷光源、括检钳、注射针、圈套器、高频电发生器、细胞刷、吸引器、润滑油等。【操作方法及程序】分双人操作或单人操作法。一、双人操作法：1.患者取左侧卧位，常规做肛门指检，除外肛门狭窄和直肠肿物。2.循腔进镜是结肠镜操作的基本原则，即视野中见到肠腔才能插镜，否则要退拉一下再找腔。3.进镜中常有几个急弯肠段，如乙状结肠、降结肠交界处，脾曲、肝曲;找肠腔如有困难，可根据见到的肠腔走行方向行滑行插人，一般滑行插人2}cm左右即现肠腔;如滑进很长距离仍不见肠腔，应该退镜另找方向再插镜。4.插镜时应该无明显阻力，若有剧烈疼痛，切忌盲目滑进和暴力插镜。5.在通过急弯肠段后，有时虽见到肠腔但仍不能进镜，相反有时会退镜，这时要退镜并钩拉取直镜身、缩短肠管，使结肠变直，锐角变钝角，再通过。若插人仍有困难，可改变患者体位或腹壁加压，避免传导支点和阻力的产生。6.整个插人过程要尽量少注气多吸气。7.一定要在视野中见到回盲瓣和阑尾口才能认为镜端已抵达盲肠，插入成功。8.必要时可通过回盲瓣插人回肠末端20～40cm。9.结肠镜观察和治疗应在插人内镜时就开始，但重点应在抵达盲肠后退镜时进行，应按先近端后远端的顺序进行。10.见到阳性病变应取活检组织2～4块，立即放人4%甲醛(10%福尔马林溶液)，并贴好标签。二、单人操作法：(一)操作的基本姿势患者基本上采取左侧卧位，原则上检查医生站在其身后。将内镜监视器摆放在便于术者观看的位置。通常放在患者的头部上方。仍可使用传统的双人操作法的位置。为了便于检查，应使用操作空间较大的检查台。左手放在与胸平行的高度握住内镜的操作部，右手握住距离肛门20～30cm处的内镜镜身软管。(二)缩短肠管与取直镜身在内镜插入过程中，保持内镜镜身呈相对直线状态，避免使肠管伸展，在缩短肠管的同时推进内镜，这是结肠镜得以顺利插入的基本要领。如果能够保持内镜镜身的直线状态，就可以直接将手部动作传递到内镜的前端而无须任何多余动作。一般来说，这种边保持直线镜身和缩短肠管，边插入镜身软管的“镜身取直缩短肠管法”，是可能完全控制内镜的大肠。在弯曲处适当地调节肠腔内气体量(气体要少!)和退镜操作，易使角度直线化(锐角转钝角)。在结肠镜插入时，弯曲的消除方法是操作成功的重要因素之一。在弯曲处，按照镜身取直缩短法的原则，将伸展的肠管缩短到最短程度，并保持镜身的直线状态。二.单人操作法的插入技巧适当保持肠管壁与内镜前端之间的距离极为重要。应保持一定的距离，应缓慢退镜至前端不退出的位置，保持足够的距离，再慢慢地一点一点地推进内镜。当穿过肠壁的皱褶后，向管腔走行的方向稍稍旋转内镜，即可插入前方的肠管。如果内镜的前端触到了肠管的内壁，画面则是全红的一片，将无法辨认内腔的位置。勉强插入，患者会感到疼痛难忍，甚至会有肠管穿孔的危险。操作过程中应尽可能少地注入空气，通过捕捉如皱褶的外形、粘膜表面的颜色等一些极细微的变化来辨别内镜的前进方向至为重要。三.操作注意事项在插入过中应始终记送气不要过量，送气过量会使肠过度扩张，导致肠管弯曲的部位形成锐角，并且送气过多会引起肠管扩张给患者带来痛苦，致使肠管缩短操作困难。当肠管急峻弯曲插入困难时，为了寻找肠腔而不断送气，常常会导致深部的肠管发生更为强烈的弯曲和扭曲。送气过量会使患者的肠管象一只吹足了气又被扭曲的气球。最后使操作医生陷入难以操作进镜的地步。送气量只要能达到使医生从粘膜皱襞方向判断出肠管的走向的程度即可。在操作不顺利时，反倒应该多使用空气抽吸法和向后退镜法，或者用手按压腹部和变换患者体位的方法为好。但送气量过少，对整个肠管的弯曲程度和正确的走向是难以判断的。【注意事项】1.检查结束后观察患者有无腹痛、腹胀、腹部压痛，若无异常。10mi,n后即可离去。:2.若有腹痛、腹胀、肝浊音界消失，应立即做腹部X线透视，如肠下有游离气体即为消化道穿孔，应立即外科手术。3.书写报告单，应详细描述阳性病变的部位、范围、大小、形状等，并解释检查结果。【并发症】1.穿孔发生率为0.11%～0.26%，最常见为乙状结肠穿孔，结肠穿孔一旦确诊应立即手术。腹腔外穿孔一般不须手术，予以禁食补液，抗感染治疗，1～2周后穿孔会自行愈合，腹膜后及皮下气肿可自行吸收。2.出血发生率为0.07%，大部分经镜下止血和保守治疗可获痊愈。3.浆膜撕裂也称不完全穿孔，较少见，一般不须特殊治疗，会自行愈合。4.肠绞痛一般为检查刺激所致，无特殊意义，能自行缓解。5.心血管意外结肠镜检查对心血管影响极其轻微，原有严重冠心病或心律失常者应慎重施行。6.呼吸抑制大部分与术前应用镇静或麻醉剂有关，一旦发生应立即复苏