《HPLC法测定五味子中五味子醇甲的含量实证探究》5800字

IIHPLC法测定五味子中五味子醇甲的含量实证研究目录摘要 I第1章前言 1第2章实验部分 31.仪器与试剂 32.方法与结果 42.1色谱条件 42.2对照品溶液的制备 42.3五味子药材的预处理 52.4五味子药材的制备 52.5线性关系考察 52.6精密度试验 52.7稳定性试验 62.8重复性试验 62.9回收率试验 62.10含量测定 6第3章结果与分析 73.1线性关系考察 73.2精密度试验 73.3稳定性试验 73.4重复性试验 73.5回收率试验 73.6含量测定 8第4章讨论 9第5章结论 10参考文献 11摘要目的：以五味子为研究对象，用高效液相色谱对五味子醇甲进行含量测定。方法：高效液相色谱采用的色谱条件：色谱柱采用Shim-packGIST柱（4.6×150mm，5m，SHIMADZU），流动相采用0.1%甲酸水-甲醇（35:65,v/v），检测波长为250nm，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，进样量为10μL。结果：五味子中五味子甲醇能够较好的分离，五味子醇甲的保留时间约为6.5min。五味子醇甲线性浓度范围5～200μg/ml（r=0.9999），平均回收率为100.1%，结论：采用高效液相色谱的方法操作简便、实验结果的准确度高。通过对五味子醇甲进行含量测定，有助于五味子相关质量控制研究。【关键词】五味子；五味子醇甲：含量测定；高效液相色谱第1章前言五味子属木兰科干燥成熟的灌木果实,又名为木药子或五味子。在2005版的《中国药典》中,第一次明确有了南方东五味子和北方南五味子的中文名称。南方北五味子主要广泛分布长江以南,四川等原产地,北方南五味子主要广泛分布于长江以北、东北三省等地。现在华南五味子植物种子的人工繁殖种植方法已经逐渐开始转为采用人工繁殖种植和利用人工繁殖促进等多种种植方法，除了种植的五味子以外,还有野生的五味子，野生华南五味子产于分布较为广泛的华南地区,在伊春地区等原生地【1】。五味子药材无论是从成分还是从品种都十分的复杂,在传统的中药中,五味子可以用来补气,解表散寒,温肺化饮,近年来五味子还可以用来治疗乙,均获得较好的疗效【2】。总的来说五味子对于心血管系统，神经系统方面的预防与治疗都具有很好的疗效，对于具有很好的保护作用，在抵抗炎症方面也可以使用，它的木脂类成分能够降低低Th2细胞相关IL-4、IL-5和IgE的水平从而减轻一些炎症【3】。北和南五味子主要生长在自然的生态环境中,由于它是近些年来由于人们对自然生态环境的严重破坏,导致了南五味子的药物产量在逐年有所减少,为了不断扩大这种药物的采收来源,有科学文献对北和南五味子除了果实之外的植物藤茎、果柄、叶的植物化学成分和植物药理活性都对此进行了深入研究【4-6】。木脂素类药物中的甲基五味子醛和醇甲等在所有五味子醇甲中都可测到,还有机酸类例如甲基柠檬酸、酒石酸、苹果酸等,此外，还含有挥发油等有效成分,不同成分疗效也不同【7-10】。五味子是一种可以作为药材也可以作为食物的植物。五味子胶囊中的一种木脂素类似物是一种脂溶性很好的化学物质,所以常常将作为五味子的有效组成部位的木脂提取物混合制作胶囊成五味软胶囊,做成制剂可以很好的被人体吸收,起到较好的疗效。在食物上也十分受欢迎,可以用五味子制作成饮料、酿酒、制作成保健品等,另外,五味子的果实营养也十分的丰富。对于五味子不同的加工方法自然对五味子的有效成分的影响也会有所不同【11】。五味子广泛应用于我国临床上,无论是在传统西医上还是在现代中医上,既然我们选择这些五味子适合用药,就要充分考虑它的治疗效果怎么样,由于这些五味子中的成分复杂,所以我们就需要对这些五味子进行预处理，对它的成分进行药物炮制,常见的药物炮制用药方法主要分为有两种,一种方法是药物醋制,醋制所可能产生的主要成分为少量醋酸和五味子,醋制药物可以有效改变一些药物的理化化学性质以及药物毒性。还有一种方法是利用酒酿清蒸,将新鲜五味子切片放入加热到温度适宜的温水容器中,加入些料酒和盐拌匀,所产生的成分是酒制五味子。由于各种五味子及其生长的地理环境不同,所以每种五味子中可能所含的有效成分的实际含量也可能会随之有所大的不同。2005版的《中国药典》论文采用高效液相测定方法进行测定水性五味子乙醛甲醇对测定五味子甲醛进行甲醇质量优化控制,规定甲醇不得含量少于0.40%。到了2010版的《中国药典》对于北五味子和南五味子中有效成分的含量分别做出了明确的规定【12-13】。北五味子的临床疗效有很多,1.可以收敛肺气,又能下摄肾气,治疗肾虚、腰膝无力、阳痿等。2.可以促进脏解毒,达到保护的效果。3.可以益气生津,与人参和麦冬配伍,以益气强阴。4.是可以收敛肺气,固涩肺气,中医用来达到治疗咳嗽的目的。五味子苷还具有极高的生物药用价值【14】。五味子在《神农本草经》、《名医别录》等书中都已经有详细记载。有个实验是专门研究五味子对小白鼠产生的疗效,通过实验结果发现五味子中五味子甲醇对于小白鼠具有抵抗炎症的功效,并且能对小白鼠进行免疫治疗【15】。五味子中的五味子醇甲能够减轻小白鼠的脑缺血再灌注损伤【16】，还能够对纤维化进行防治【17】。五味子的功效与作用也不断的增加,五味子药材中的五味子醇甲等可以治疗艾滋病、治疗癌症、以及PAF拮抗等【18】。如今,五味子合剂也在临床中应用十分广泛。五味子中具有较强的药理学活性。通过对五味子中五味子醇甲的测定,为今后的五味子在医药行业和饮品行业等提供一定的依据。第2章实验部分1.仪器与试剂仪器：本实验使用的是高效液相色谱仪是由日本岛津公司生产的(LC-20AT)；天津市泰斯特仪器有限公司生产的微型万能粉碎机(FW80)；上海精密科学仪器有限公司生产的电子天平(FA1104N)；河南金鼐科技发展有限公司生产的(JHBE-50S)闪式提取器；昆山市超声仪器有限公司生产的(KQ-500GVDV)三频恒温数控超声波清洗器。试剂：北五味子树的果实购于吉林市吉林大药房；上海源叶生物科技有限公司生产的五味子醇甲对照品，纯度大于98%，对照品批号：Y17M8H31887，化学结构见图1，永大化学试剂有限公司生产的HPLC级甲醇：Fisher；无水乙醇（AR）。图1五味子醇甲的化学结构2.方法与结果2.1色谱条件色谱柱主要采用柱式Shim-packGIST柱（4.6×150mm，5m，SHIMADZU），流动相采用的溶液是0.1%甲酸水-甲醇（35:65,v/v），通过对检测波长的考察，发现检测波长设置为250nm较为合适，流速设置为1.0mL/min，柱温为35℃，取样品10μL分析。图2-1为五味子甲醇对照品色谱图，图2-2为五味子样品的色谱图。图2-1五味子甲醇对照品色谱图图2-2五味子样品色谱图2.2对照品溶液的制备取10mL容量瓶，取适量的五味子醇甲对照品，用适量的甲醇作为溶剂，定容至容量瓶的刻度线，摇匀，就可得到配置成的含五味子醇甲的对照品的溶液含量为1.0mg/ml，备用。2.3五味子药材的预处理取干燥后的五味子药材适量于药材粉碎机中粉碎，备用。2.4五味子药材的制备取目数为40的中药目筛，把粉碎机粉碎过的五味子药材进行再次过筛，用电子天平仪器进行称量，取五味子药材粉末适量,放置于250ml的具塞锥形瓶，把提取的五味子药材放入到具塞锥形瓶中，用量筒量取50%的乙醇250ml,，用超声仪对提取的五味子药材进行超声提取，设置超声功率为150W,设置药材提取后的时间长度为0.75h,再次对五味子的药材进行质量称定，摇匀，用一个玻璃漏斗进行过滤，过滤之后用0.22μm微孔滤膜过滤，然后把滤液取出作为供试品溶液。2.5线性关系考察按照“2.2”项下制备五味子醇甲对照品系列溶液，用甲醇溶液作为溶剂进行稀释配置后制成一系列浓度为5、10、20、50、100、200ug/ml的六个五味子醇甲对照品溶液，把每个五味子醇甲对照品进行移液依次注入到色谱仪的1，2，3，4，5，6号位中，进行测定，得到6个不同的五味子醇甲对照品的峰面积，将每个五味子醇甲对照品峰面积作为坐标轴的纵坐标（Y）,用每个五味子醇甲对照品的浓度作为坐标轴的横坐标为（X）,计算其回归方程。2.6精密度试验用移液枪随机吸取五味子甲醇50μg/ml的对照品适量，把对照品注入到7号位中，按照上述的色谱测定条件进行6次进样，得到6个色谱结果，记录6次得到的对照品的峰面积。2.7稳定性试验取在上述进行预处理的五味子粉末，用上述“2.2”下的配置方法进行配置，得到供试品溶液，用上述“2.1”下的方法色谱条件对色谱仪进行设置，放在8号位中，时间分别为0、2、4、8、12、24h的每个时间进行六次进样，分别记录这6个不同时间段的峰面积。2.8重复性试验取五味子药材平均分成6份，进行称量，把药材放入到具塞锥形瓶中，加入乙醇，制成待测液，把这6份待测液分别放在9-14号位中，进样分析，得到6个峰面积，代入五味子对照品的回归方程得出对照品浓度，计算五味子的含量。为4.72mg/g，RSD为1.9%，从实验结果可知方法重复性良好。2.9回收率试验用电子天平称量三份五味子粉末，分别向这3份样品加入相当于样品中五味子醇甲的含量为80%、100%、120%的对照品溶液3份，把它们分别注入到15-17号瓶位中，进行3次进样分析，根据峰的峰面积计算五味子醇甲的回收率和RSD。2.10含量测定取6个不同批次的五味子药材，按上述的实验方法配制成供试品溶液，把供试品溶液依次注入到18-20号瓶位中，记录6次的峰面积，根据峰面积，计算五味子药材的含量。结果与分析3.1线性关系考察获得的五味子醇甲的线性回归方程为Y=2.086×104X–4.1123×103(r=0.9999)，五味子醇甲对照品溶度在5～200μg/mL范围内的线性关系比较好。3.2精密度试验计算6次峰面积的RSD为0.06%，从实验结果可以看得出该色谱仪的精密度良好。3.3稳定性试验根据峰的峰面积计算6次峰面积的RSD为1.01%，从实验结果可以看得出五味子药材的稳定性很好，在24h内稳定。3.4重复性试验计算五味子醇甲含量为4.72mg/g，RSD为1.9%，从实验结果可知方法重复性良好。3.5回收率试验计算结果如表3-1。平均回收率为100.1%，RSD为0.7%，从实验结果可以看出该方法的准确性良好。表3-1五味子甲醇的回收率和RSD组分Component样品中含量/mgContentinsample加入量/mgAdd测得量/mgMeasure回收率/%RecoveryRSD/%平均值/%Mean五味子醇甲0.04720.03780.0852100.50.7100.10.04720.04720.0945100.20.80.04720.05650.103699.80.73.6含量测定计算结果见表3-2。表3-26批次五味子药材中五味子醇甲的含量批号（LotNo.）五味子醇甲/（mg/g）20210014.7920210024.9320210034.6820210044.6920210054.7420210064.76第4章讨论本实验采用了Shim-packGIST（4.6×150mm，5m，SHIMADZU）色谱柱，选用程序洗脱能使五味子醇甲的分离度好，但是，由于我们的杂质与主成分相差不大，并且分离度好，所以我们本实验选用的是等度洗脱。我们流动相采用的是0.1%甲酸水-甲醇溶液（35:65,v/v）。柱温对实验结果的影响较大，所以在选择温度的时候要恰当，我们选择的是35℃，从实验结果可以看出这个柱温下分离较好。在2020年版《中国药典》中写到，检测波长为250nm【19】。所以我们在高效液相色谱仪上设置的波长为250nm。参考了药典处理五味子药材，超声提取五味子醇甲，用该方法简便快捷。有一项研究结果表明，甲醇提取的样品色谱图杂质峰较多，与五味子醇甲峰基线分离效果不好【20】。之后发现乙醇作为提取剂效果更好，同时在工业生产中乙醇的价格便宜并且在使用过程中比甲醇更加安全，所以我们采用的是用乙醇为提取溶剂。五味子药材在传统中医和西医上广泛应用，有关研究结果表明，五味子中有效成分木脂素类具有镇静催眠的有效作用,但是都是以北五味子作为代表,他们都认为北五味子在质量上优于南五味子,有实验结果表明,南五味子与北五味子一样同样含有木脂素的主要成分五味子醇甲和五味子酯甲【21】。其他医学文献也有证据报道南五味子和北五味子同样具有较强的生物药理学活性【22-23】。五味子是一种天然药用美食营养兼用的植物。同时不同原料产地的五味子中的五味子醇甲和木脂素类总含量存在明显差异，可能主要与当地的环境位置与气候存在很大的关系。但是五味子存在道地性，需符合药典规定。测定五味子中五味子醇甲的含量，结果表明五味子醇甲的线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重复性试验、回收率试验结果良好，五味子醇甲峰的分离效果良好，可保证在临床用药过程中的稳定性和安全性，用高效液相的方法，该方法简便快捷，以五味子醇甲为测定指标，可以为五味子药材的质量控制提供参考。第5章结论我们采用高效液相色谱法，实验方便快速。通过实验我们对五味子样品和五味子醇甲对照品都进行了进样分析，用色谱仪对五味子中的五味子醇甲进行含量测定，为今后五味子药材提供理论依据。参考文献[1]胥克章.北五味子GAP基地的栽培及管理技术口.农业与技术．2006，26(2)：126—128[2]赵景辉,王再幸,赵伟刚,等.高压脉冲电场法快速提取北五味子中五味子醇甲的工艺研究[J].天然产物研究与开发,2011,23(4):755-757.DOI:10.3969/j.issn.1001-6880.2011.04.039.[3]孙靖辉,吕希,王春梅,等.五味子木脂素对哮喘模型小鼠Th2相关炎症因子的影响[J].北华大学学报(自然科学版),2020,21(03):325–328.[4]南京中医药大学．中药大辞典嗍.上海：上海科学技术出版社，2006：518．522．琳，何晓霞，赵余庆，等.五味子果柄化学成分研究[J].中药材，2009，32(13):1054-1057.[5]金银萍，焉石，郑培和，等.五味子根化学成分研究[J].特产研究，2011，3:56-59.@@[6]魏忠宝，孙成贺.五味子根、藤茎及叶提取物中五味子甲素、乙素的含量测定[J].特产研究，2009，4:56-58[7]汤臣康．五昧子的化学成分和药理研究的新进展[J].西北药学杂志，1994，9(6)：278-282．[8]HanekeJL，BurgosRA，lumadaFA．Schisandrachineno8i8Baill[M]．Fitoterapia，1999：70．．451．[9]SongWazhi，XiaoPeigen．Medicinalplantsandli鲥nconstituentsofSchisandrasphermantheraRehd．ctwils[J]．ChinTraditHerbDrugs，1982，13(1)：41-45．[10]TongYu-yi，SongWanzlIi．TheoccurrenceofsomeimporrantlignansinWuweizi(SchisandraChlnensis)anditsAlliedspecies[J]．Acta['harmSin，1983，18(2)：138.142．[11]琦，王龙虎．现代中药炮制与质量控制技术．北京：化学工业出版社，2005：105．[12]中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[s]．北京：化学工业出版社．2010：227—228．[13]中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典(一都)[S]．北京：化学工业出版社，2000：197．[14]谭忠谋，杨帆，韦升坚．HPLC法测定消渴灵片中五味子醇甲的含量[J]．中国中医药现代远程教育，20