《烟草主要病毒核酸恒温扩增检测技术报告》

烟草主要病毒核酸恒温扩增检测技术报告1、项目背景近年来,病毒病在世界各国的危害日趋严重,所发现和报道的种类日益增多，危害烟草的病毒有烟草花叶病毒(TabacooMosaicVirus,TMV)、黄瓜花叶病毒(CucumberMosaicVirus,CMV)、马铃薯X病毒(PotatoVirusX,PVX)、马铃薯Y病毒(PotatoVirusY,PVY)、烟草蚀纹病毒(TabacooEtchVirus,TEV)、烟草环斑病毒(TabacooRingSpotVirus,TRSV)等十几种病毒。其中烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒是引起烟草病毒病的主要病毒,严重影响烟草的产量和质量，造成重大的经济损失，对烟草生产威胁很大。对为害烟草的病毒进行有效和快速检测，对于预防和控制烟草病毒病具有十分重要的现实意义。烟草病毒病在世界各烟区都普遍发生，是我国烟草危害最重要的病害。病毒病的发生严重影响烟叶的产量和质量，给我国烟草生产造成了重大的经济损失。因此开发新的技术快速、准确、灵敏地检测烟草主要病毒病，加强漂浮育苗苗期检疫以及栽培土壤环境的监测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国烟草生产的健康持续发展具有重要意义。目前用于烟草病毒检测的方法主要有生物学诊断、电子显微镜、酶联免疫吸附技术（ELISA）以及分子生物学等方法：生物学方法主要是鉴别寄主反应或指示植物等，这种仅仅以鉴别寄主反应或指示植物为依据的方法,虽曾广泛运用,却由于其检测速度慢、受环境和季节影响较大等诸多因素限制而运用较少。电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长；酶联免疫吸附技术（ELISA）虽具简便、快速等优点,但灵敏度较差,且存在非特异性反应；上述三种方法均不能快速、简便、准确地检测烟草普通花叶病毒和马铃薯Y病毒。近年来发展起来的以分子生物学技术为基础的病毒检测方法主要有RT-PCR法以及PCR微量板杂交等检测方法，克服了上述三种方法的缺点，在实验室条件下实现了烟草普通花叶病毒的相对快速、准确检测。由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪，凝胶电泳和成像系统等大大限制了这些检测方法在生产中的推广应用。环介导等温扩增技术是2000年由Notomi等发明的。该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在一定温度下对核酸进行等温扩增。最近几年已开始应用于生物致病病原的检测。到目前为止，尚未见利用LAMP技术检测烟草普通花叶病毒和马铃薯Y病毒的报道。本研究的目的是提供烟草普通花叶病毒和马铃薯Y病毒环介导等温扩增检测方法，以实现能对这两种烟草病毒病进行快速、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有技术的不足。本项目自2010年1月份国家烟草专卖局下达了项目任务后，积极自筹经费，在中国烟草资源平台的支持下，依据目标任务、起止时间按照技术路线、实施方案、预期成果开展相关技术研究。项目从论证、立项、实施至总结计划开展2年研究，到2011年10月结束，项目按期完成。2、主要技术内容2.1设计用于检测主要烟草病毒病的的LAMP引物序列：分别针对烟草花叶和马铃薯Y病毒的衣壳蛋白基因中保守区段设计的4条特异引物，使所提供的引物能有效检测目前生产中的两种烟草病毒病，且检测特异性好。2.2研究样品的取样、处理方法：戴一次性PE手套，取样品组织约0.02～1.0g置于采样管中，用研磨棒将样品组织磨碎至浆状。2.3优化RNA提取、纯化技术提取体系：用研磨棒蘸取浆状的样品组织将FTA膜片充分润湿，吸取亲水性且易挥发的叔醇滴于上述FTA膜片上，静置1~20min，获得吸附于FTA上的病毒RNA。2.4规范检测结果的判断标准：选择核酸染料GeneFinderTM加入反应体系，绿色为阳性（感染目标病毒），橙色为阴性（未感染目标病毒）2.5优化、规范主要病毒病的LAMP检测技术，利用将核算染料粘附到扩增反应管的内侧上方或盖子内侧，有效消除污染风险。3、技术关键3.1技术特点：Loop-mediatedisothermalamplificationmethod（LAMP）：环介导的恒温扩增方法，是一种新式恒温核酸扩增方法,采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase),在恒温条件(60～65℃),进行核酸的指数级扩增,在45～60min的时间里其扩增效率可达到109～1010个数量级。在扩增反应中产生茎———环结构,引物与其杂交启动新一轮核酸合成。本研究利用针对目标病毒的衣壳蛋白基因中保守区段设计的4条特异引物、一种反转录酶和一种Bst链置换酶，无需单独对目的核酸（RNA）进行反转录，在恒定温度下保温一段时间即可同步完成对目的核酸的反转录和扩增，实现对两种病毒病的快速和高灵敏检测，建立了适用于烟草主要病毒病监测的RT-LAMP（reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationmethod）。3.2关键技术：提供检测两种病毒病的LAMP特异引物；优化病毒RNA的提取程序；在不增加成本的条件下，避免现场检测出现交叉污染，实现快速、准确的检测判断。4、方法制定4.1影响因素的研究：优化LAMP反应检测体系（1）Mg2+浓度图1ART-LAMP优化.在63C条件下Mg2+浓度的影响泳道从右到左1–8:1mM，2mM，3mM，4,5,6,7and8mMMgCl2,M：DNAmarkerDL2000由图1A可以看出，当Mg2+离子浓度低于4mM时，不能进行扩增反应，Mg2+离子浓度达到5mM时，产物量比较大，检测结果清晰、明了，当Mg2+离子浓度大于5mM时，反应产物没有明显的增加，因此优化Mg2+离子浓度为5mM。（2）反应温度图2BRT-LAMP优化.5mMMgCl2条件下温度的影响，泳道从左到右1–6:20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，65C，M：DNAmarkerDL2000由图2B可以看出，当温度低于50℃时，扩增不能被检测到，到温度达到60℃时，扩增产物量大，可明显检测到，65℃时，同样能得到很好的效果，因此，考虑到田间检测保温设施散热等因素，优化温度为65℃。（3）反应时间图3C在5mMMgCl2和65C温度条件下，反应时间的影响，泳道从左到右1–5:15分钟，30分钟，45分钟，60分钟，75分钟，M：DNAmarkerDL2000由图3C可以看出，反应时间低于45分钟时，不能检测到反应产物，当反应时间达到60分钟时，反应产物量大，易于被检测到，因此优化反应时间为60分钟。4.2取样方法戴一次性PE手套取烟叶（幼叶、老叶）样品约（0.02～1.0）g置于（1.5～2.5）ml灭菌试管中，用研磨棒将样品组织磨碎至浆状，用研磨棒蘸取浆状的样品组织将FTA膜片充分润湿，吸取亲水性且易挥发的叔醇滴于上述FTA膜片上，静置（1~20）min，获得吸附于FTA上的病毒RNA。每样品换一次PE手套。4.3灵敏度检测PCR反应体系：总PCR反应体系20μL，包括2.5μL10×buffer,1.5μLMgCl2(1.9mM),0.5μLdNTP混合液(每种dNTP10mM),0.25μLTaq聚合酶(4U/μL;Promega,USA),每种引物1μL(10lM),12.25μLDEPC-treatedH2Oand1μL模板cDNA.扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸60sec，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存，反应产物用用2%琼脂糖电泳。RT-LAMP反应体系：总体系25μL，包括FIP和BIP引物各1.6μM,F3，B3各引物0.2μM，1×反应Buffer(20mMTris–HCl,10mMKCl,2mMMgSO4,10mM(NH4)2SO4,0.1%TritonX-100),5mMMgCl2,1mM甜菜碱,每种dNTP1.4mM,1μL(8U)BstDNA聚合酶(NEB),0.5μL模板RNA,0.2μL(8U)反转录酶(Fermentas),最后加双蒸水至25μL.反应条件为65℃，反应时间为60分钟，反应产物用用2%琼脂糖电泳。图4RT-LAMP和RT-PCR灵敏度检测的影响（TMV）A.pMD18-T-TMVPCR灵敏度检测.B.pMD18-T-TMVLAMP灵敏度检测M:DNAmarkerDL2000.泳道模板浓度以10的数量级稀释，1–8分别是7×100–7×107病毒粒子。由图4A可以看出，PCR灵敏度检测从第4泳道7×103开始检测出产物，图4B从第二泳道7×101可以检测出产物，因此RT-LAMP最低检测极限为70个病毒粒子，灵敏度比普通PCR高100倍。4.4评价方法向反应产物中加入0.2μLGenefindertm，裸眼就可判断出检测结果，不需要专业的技术知识，阳性为绿色，阴性为橙色。图5TMVRT-LAMP产物显色检测试管从左到右分别是TMV阳性对照，TMV阴性对照，最后两个是检测叶片，入阳性为绿色，阴性为橙色。4.5检测方法（1）特异引物序列TMV特异引物序列FIP5’-GCACCACGTGTGATTACGGACATTTTGACCTCTGGTCCTGCAACT-3’BIP5’-AAGGGTTGTGTCTTGGATCGCGTTTTTTACGTGCCTGCGGATGT-3’F3：5’-CGAGAGCTCTTCTGGTTTGG-3’B3：5’-GATTCGAACCCCTCGCTTTA-3’PVY特异引物序列FIP5'-ACCCACATCCCGCAGATTTCGTTTTATGCGCAACAAAAAGGAACC-3’BIP5'-ACATCACGAACACCAGTGAGGGTTTTTTTCAATGCTGCGGCCTTC-3’F3：5'-CTCAGATGTTGCAGAAGCGT-3’B3：5'-AAGTCGAGGTTGGGCTGA-3’。（2）取烟叶样品0.05g+置于采样管中，用研磨棒将样品组织磨碎至浆状；（3）用研磨棒蘸取浆状的样品组织将FTA膜片充分润湿；（4）吸取叔醇滴于上述FTA膜片上，静置1~20min；（5）用牙签将上述FTA膜片转移到蒸馏水内，震荡漂洗管3~5min以洗涤FTA膜片；（6）再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于65ºC条件下保温60min；（7）将扩增检测管上下反复甩动1-3min；（8）用力向下甩动扩增检测管，使管内混有染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的PVY或TMV检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的PVY或TMV检测结果为阴性。5、总结本研究对这两种烟草病毒病进行快速、特异、灵敏、简便的现场检测，可使得TMV、PVY的检测能够快速有序地进行，可实现其检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错。对加强烟草病毒病的流行病学监测和病害防控意义重大，具有很高的推广应用价值，结论如下：1．引物特异性强依据优选的TMV、PVY衣壳蛋白保守区序列所设计的扩增引物能有效检测几乎所有TMV、PVY的病毒株系，而与其他病毒的衣壳蛋白又无同源性，检测特异性非常好；2．检测准确采用内置染料的方法，在反应结束后不用打开反应管即可直接对反应液进行染色，避免了打开反应管再添加染料使后续待检样品被扩增产物污染而造成假阳性的结果，从而大大提高了该方法在检测中应用的可靠性。3．灵敏度高检测灵敏度比普通PCR提高