HIV检测及临床意义

HIV检测及临床意义中国医科大学附属一院艾滋病确认试验室尚红——HIV的发现Montagnie(LAS)1983.Science220:868-871Gallo(HTLV)1983.Science220:865-86Levy(ARV)1984.Science225:840-842

1986国际病毒分类委员会：HIVHIV-21986

西非中国每年新发现的HIV/AIDS

病例数（1985~）2HIV感染可通过两种途径检测直接检测病毒或其构成部分检测人体HIV免疫反应——HIV特异性抗体从感染到血清抗体阳转有一段窗口期，平均为1-3个月，有一小部分HIV感染者出现延迟反应HIV感染后抗原和抗体的变化

及其与疾病关系HIV感染人体后出现一过性病毒血症，6-8周后血清抗体阳转，病毒滴度减少，在随即的5-8年无症状带毒期里HIV抗体一直存在，但病毒难查到。进入AIDS期后血浆中病毒再次出现。故诊断HIV感染多数时间用抗体检测诊断，极初期（窗口期）用抗原检测。HIV抗体诊断 目前临床上实际应用的是测定特异性HIV抗体，包括初筛和确认试验。一、检测试剂筛查试剂必须是HIV-1/2混合型、经国家药物监督管理局注册同意、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。目前常用的筛查试剂有酶联免疫、颗粒凝集和其他迅速诊断试剂。采供血机构进行血液筛查应采用酶联免疫试剂。自采自供血的单位必须进行HIV抗体检测，在尚未建立艾滋病筛查试验室的偏远地区可由通过培训的技术人员在规定的场所用迅速试剂进行血液筛查。62、确认试剂必须经国家药物监督管理局注册同意。确认试剂包括免疫印迹试验、条带免疫试验及免疫荧光试验试剂。目前以免疫印迹试剂最为常用。ELISA措施： 目前最常用的初筛试验，自1985年初次检测HIV-1抗体的试剂盒供市以来，已从第一代的全病毒抗原间接法发展到第四代的以重组的多肽抗原及抗P24抗体包被的双夹心法，使窗口期缩短了2-3周。四代艾滋病酶联免疫试剂比较solidphasespecificdetectionofconjugate第一代病毒裂解液HIV-1IgG抗体HIV-1-IgG抗体第二代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2IgG抗体HIV-1/-2IgG抗体第三代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-OIgM/IgG抗体HIV-1/-2/-O病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-O第四代病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24AbIgM/IgG抗体HIV-1/-2/-Op24抗原病毒裂解液重组抗原合成肽HIV-1/-2/-Oanti-p24抗体Closingthewindow<infectivity=>4thgen3rdgen=>

=>1st-2ndgenHIVantigenIgMabIgGabDetectionlimit<=window第一代试剂检测IgG抗体，第三代试剂检测IgG、IgM抗体,第四代试剂同步检测IgG、IgM抗体和P24抗原使窗口期缩短。检测成果的汇报和处理阴性反应出具HIV抗体阴性汇报，假如近期有高危行为，如性乱、注射毒品等，或有急性流感样症状等状况，为排除“窗口期”的也许，可以进行HIV-1P24抗原或HIV核酸检测，或2－3个月后来再做抗体检测。筛查试验呈阳性发现反应，可出具“HIV抗体待复查”的汇报，不能出阳性汇报。样本初筛检测一阴一阳均阳性反应阴性报告送确认重复检测阴性报告均阴性反应阳性反应原有试剂＋另一种原理初筛试剂选用初筛试剂阴性反应HIV抗体初筛检测流程图迅速诊断试剂：采用乳胶凝集、免疫斑点和免疫层析三种原理迅速、不需特殊仪器敏感度、特异度低于ELISA，且价格贵合用于血站覆盖不到的边远地区/都市大医院急诊手术前检查迅速诊断阳性成果还需经ELISA措施验证HIV抗体确认常用确实认试验措施是免疫印迹法（WB）。免疫印迹试剂有HIV-1/2混合型和单一型。一般先用HIV-1/2混合型试剂进行检测蛋白印迹试验（WB） ——广泛使用确实认试验用聚丙烯酰胺凝胶电泳将纯化的HIV蛋白抗原分开后转移到硝酸纤维膜上。标本中存在的HIV抗体与条带上的抗原结合，再加入酶偶联的抗人IgG抗体和底物，在抗原抗体结合的部位会出既有色条带其可检测标本中针对HIV不一样抗原的抗体，故被用做确认试剂。不一样的研究机构有不一样的鉴定原则WB成果鉴定原则组织阳性阴性WHO2ENV+GAG+POL无条带或只有P17FDA（USA）1ENV+p24/p31无条带CHINA２ENV或１ENV+p24无HIV-1特异性条带“不确定”(±)：出现HIV-1特异性条带，但带型局限性以 确认阳性，每三个月随访一次，共两次， 仍属可疑，判为阴性HIV-1抗体特异带HIV-2抗体特异带envgp160/gp120gp41gp140/gp105、gp36，也可为gp125/gp80、gp36gagp55、p24、p17（或p18）p56、p26、p16polp66（或p65）、p51、p31p68、p53、p34

HIV抗体确认检测流程图免疫印迹法(HIV1/2混合型)HIV-1阳性反应可疑反应出现HIV-2指带HIV-1阳性汇报可疑反应阳性反应阴性反应汇报HIV-2血清学阳性反应汇报必要时测核酸阴性汇报免疫印迹法（HIV-2）每3个月随访一次，共2次，仍属可疑，则作阴性汇报如随访期间出现阳性反应则汇报阳性阴性反应阴性汇报

P24抗原测定（一）合用范围HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV-1抗体确认阴性者的诊断。监测病程进展和抗病毒治疗效果。（三）成果汇报和解释

1、HIV-1P24抗原的阳性成果必须通过中和试验确认。2、HIV-1P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断根据，不能依此确诊。3、HIV-1P24抗原阴性成果只表达在本试验中无反应，不能排除HIV感染。HIV核酸检测

1、辅助诊断某些非经典的抗体反应，尤其是不确定反应时，RNA的测定可提供非常有用的证据。单纯使用RNA测定不能完全确定感染与否，但当RNA测定出现较高拷贝数的阳性成果时（>1000）提醒感染发生的也许性非常大。使用此指标应综合其他检测数据和样品背景状况进行综合分析与判断。222、窗口期辅助诊断在窗口期抗原峰出现前后一般出现一种病毒载量的高峰，一般此高峰高于发病时的血浆病毒水平，初期病毒RNA测定具有特殊的意义。目前国际上正在尝试使用这种检测对采供血样品进行多种样品混合后的RNA检测以减少窗口期传播的残存危险度。3、病程监控由于HIV感染发生后病毒载量的变化具有一定规律，并且这种变化与疾病的进程有着亲密的有关性。一般在感染后无症状期内发生的临床症状很难与AIDS发病时的症状区别，病毒载量测定可以协助医生判断一种刚发生的症状与否与HIV感染有关。4、指导治疗方案及疗效测定并非在任何状况下感染者都应当进行抗病毒治疗，这不仅是经济上的原因，更重要的是在于抗病毒药物的副作用和疗效。一般在病毒载量到达一定水平后（如>35000-50000拷贝/毫升）才具有良好的效果。只有通过治疗后病毒水平的检测才能确定治疗与否有效，一般治疗后病毒水平减少50%才被认为临床有效。通过监测病毒滴度反应疗效255、预测疾病进程HIV疾病进程与病毒载量的关系十分亲密，观测感染者病毒RNA水平可大体预测其发病的也许。如右图所示，病毒载量与6年发病率的关系为：<500时5.4%，501-3000时16.6%，3001-10000时31.7%，10001-30000时55.2%，>30000时则为80%。26定性检测HIV核酸检测有定性和定量两类，定性检测用于HIV感染的辅助诊断。一般使用PCR或RT-PCR技术，使用分子生物学试验室通用的扩增试剂，引物可来自文献或自行设计，应尽量涵盖所有的或常见的毒株，也可使用复合引物。27

定量检测定量检测常用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。目前常用的HIVRNA定量测定措施有逆转录PCR试验（RT-PCR）、核酸序列扩增试验（NASBA）、分支DNA杂交试验（bDNA）等，这几种进口试剂盒的最低检测限为20-50拷贝/毫升按照仪器读数汇报成果，应注明使用的试验措施、样品种类和样品量。测定成果不不小于最低检测限时，应注明最低检测限水平。注意低于最低检测限的成果不能排除HIV感染。应附上仪器打印的数据。28

RocheBayer(前Chiron)Organon技术RT-PCRbDNANuclisensHIV-1QT结果比较约2xbDNA2.02.0版结果约为RT-PCR的50%，3.0版结果与Roche基本相同与Roche基本相同优点通过了FDA认证假阳性结果较bDNA少1.5版对A-G亚型有较好的反应性操作时间较少对A-G亚型有较好的反应性通过了FDA认证可使用多种组织，如生殖道分泌液对A-G亚型有较好的反应性检测范围大缺点操作容易污染测定范围较小（相对于NASBA）少数生物样品反应受抑制，如精液、乳汁和唾液早期版本对部分亚型反应性较差，1.0版对非B亚型的样品反应性普遍较差，（5）版通过改进对O亚型检测能力较差对低值样品检测的特异性较差。无内部质量控制，尤其在3.0版中为单孔检测时，无法控制由于提取或加样操作的失误。不同版本间差异较大，2.0版约为RT-PCR50%，3.0版结果与Roche基本相同表明两个版本间差异可能达到50%。对除血浆、血清外的大部分体液样品无法进行检测。对抗凝剂敏感，只能使用EDTA。早期版本（NASBA）对部分亚型（G亚型）反应性差。操作复杂，样品提取(不使用自动提取仪时)和测定反应时需要进行大量的手工操作。不适合一次大量检测，ECL读数仪每次只能进行12个样品的检测。实验内、外误差相对较大。检测范围标准版(Amplicor1.0及1.5)

400-750,000c/mL超敏版(Ultra-Direct1.0and1.5):

50-75,000c/mLbDNA3.0版:100-500,000c/mLNuclisensHIV-1QT:40-10,000,000

c/mL(取决于样品量)多种HIV定量检测措施的比较有关不一样HIV定量检测措施的选择目前用于统一不一样定量措施检测值的原则品还没有问世不一样定量措施成果之间还无法直接比较同一病人治疗前后提议用同一措施进行HIV定量检测艾滋病免疫指标的检测

伴随政府加速对国产抗艾滋病药物上市的同意，我国艾滋病人的治疗已经出现了曙光。艾滋病临床治疗中多种免疫指标(CD4+、CD8+T细胞等)对于确定感染状态、预测发病、评价药物疗效及新药开发具有重要的作用。CD4T淋巴细胞：（流式细胞术） CD4T细胞是HIV的重要靶细胞,感染后伴随病程进展，CD4T细胞不停下降 <500/mm3——有临床诊断意义 <200/mm3——AIDS[CDC]病程进展，AIDS诊断和疗效观测的指标HIV感染几周内，出现类流感症状，也称为血清阳转期，CD4细胞的数量减少。随之出现的免疫应答可以控制急性症状，恢复CD4细胞的数量，但并不能清除病毒。伴随CD4细胞不停下降，当降至500/ul左右时，开始出现机会性感染或其他疾病，进入症状期。当CD4低于200/ul时，即进入艾滋病期。CD4+T淋巴细胞不不小于350/ul（结合病毒载量，确定治疗时机）有效治疗8周后CD4+T淋巴细胞数量增加50/ulHAART无效CD4+T细胞数量下降CD4+T淋巴细胞介导的免疫功能逐渐丧失C