第十章 高效液相色谱法课件

2025/1/118高效液相色谱法第十章

高效液相色谱法第一节固定相和流动相

第二节高效液相色谱仪

第三节液-固色谱法

第四节化学键合相色谱法

第五节离子交换色谱法

第六节尺寸排阻色谱法

第七节分离方式的选择及应用

2025/1/118高效液相色谱法色谱法分类示意图2025/1/118高效液相色谱法概述高效液相色谱法是在气相色谱和经典液相色谱的基础上70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率和实现了自动化

操作。经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9

107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。2025/1/118高效液相色谱法一、HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1．经典LC：仅做为一种分离手段

柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm且不均匀常压输送流动相柱效低（H↑，n↓）分析周期长无法在线检测2．HPLC：分离和分析

柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）高压输送流动相柱效高（H↓，n↑）分析时间大大缩短可以在线检测2025/1/118高效液相色谱法二、HPLC与GC差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1．分析对象

GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2025/1/118高效液相色谱法2．流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3．操作条件差别

GC：加温操作

HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）2025/1/118高效液相色谱法第一节

固定相和流动相一、固定相二、流动相2025/1/118高效液相色谱法一、固定相

1.高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。（1）刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0

108

～

1.0

109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。（2）硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5

108Pa。2025/1/118高效液相色谱法

2.固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。（1）表面多孔型固定相

它的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最大允许量受到限制。2025/1/118高效液相色谱法（2）全多孔型固定相由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。这类固定相由于颗粒很细（5～10

m），孔较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。2025/1/118高效液相色谱法

表10-1两类固定相的性能比较2025/1/118高效液相色谱法二、流动相

对流动相的要求是：1.纯度高由于高效液相色谱灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。2.粘度低若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、甲醇和乙腈等；但粘度过低的溶剂也不宜采用，例如戊烷和乙醚等，它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。2025/1/118高效液相色谱法3.化学稳定性好

不能选与样品发生反应或聚合的溶剂4.

溶剂沸点要高于55℃

低沸点溶剂挥发度大，容易使流动相浓度或组成发生变化，也容易产生气泡5.

溶剂要能完全浸润固定相溶剂对所测定的组分要有合适的极性，最好选择样品的溶剂作流动相，否则发生溶剂与流动相不相混溶的情况，使分离变坏2025/1/118高效液相色谱法6.溶剂与检测器匹配

对于紫外吸收检测器，所选择的溶剂在检测器的工作波长下不能有紫外吸收。

对于折光率检测器，要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达到最高灵敏度。2025/1/118高效液相色谱法第二节

高效液相色谱仪

highperformanceliquidchromatograph一、液相色谱仪器二、流程及主要部件

2025/1/118高效液相色谱法一、液相色谱仪器

highperformanceliquidchromatograph2025/1/118高效液相色谱法液相色谱仪（2）2025/1/118高效液相色谱法液相色谱仪（3）2025/1/118高效液相色谱法液相色谱仪（4）2025/1/118高效液相色谱法二、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程2025/1/118高效液相色谱法高效液相色谱仪流程图1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置图10-1高效液相色谱仪结构方块图2025/1/118高效液相色谱法2.主要部件高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成。分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。

2025/1/118高效液相色谱法（1）高压输液系统溶剂贮存器高压泵梯度洗脱装置压力表

2025/1/118高效液相色谱法A.溶剂贮存器

溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。

2025/1/118高效液相色谱法B.高压输液泵

高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。

2025/1/118高效液相色谱法续前高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。2025/1/118高效液相色谱法C.梯度洗脱装置

梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。

梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。

2025/1/118高效液相色谱法梯度洗脱装置外梯度:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2025/1/118高效液相色谱法图示2025/1/118高效液相色谱法（2）进样系统

进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。2025/1/118高效液相色谱法进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：2025/1/118高效液相色谱法（3）分离系统分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2~6mm，柱长为10~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。2025/1/118高效液相色谱法高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2025/1/118高效液相色谱法（4）检测器检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。2025/1/118高效液相色谱法a.紫外检测器

应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：

灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；

对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

2025/1/118高效液相色谱法b.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2025/1/118高效液相色谱法2025/1/118高效液相色谱法c.示差折光检测器

（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；2025/1/118高效液相色谱法d.荧光检测器

（fluorescencedetector）高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；2025/1/118高效液相色谱法第三节

液-固色谱法一、原理二、固定相三、流动相liquid-solidadsorptionchromatograph2025/1/118高效液相色谱法液固色谱的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，位于其表面的原子、离子或分子的性质是多少不同于在内部的原子、离子或分子的性质的。表层的键因缺乏覆盖层结构而受到扰动。因此，表层一般处于较高的能级，存在一些分散的具有表面活性的吸附中心

。因此，液固色谱法是根据各组分在固定相上的吸附能力的差异进行分离，分离前提：K不等或k不等,故也称为液固吸附色谱。

一、原理2025/1/118高效液相色谱法

吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及洗脱液的性质等。组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附，呈现高的保留值；当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物。吸附色谱对同系物没有选择性（即对分子量的选择性小），不能用该法分离分子量不同的化合物。2025/1/118高效液相色谱法二、固定相

液固色谱法采用的固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型。1.极性吸附剂：包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。特点：峰易拖尾;适用：分离极性化合物极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。2025/1/118高效液相色谱法2.非极性吸附剂：

最常见的是活性炭。

各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物在现代液相色谱中，硅胶不仅作为液固吸附色谱固定相，还可作为液液分配色谱的载体和键合相色谱填料的基体。2025/1/118高效液相色谱法三、流动相液-固色谱的流动相必须符合下列要求：

1.能溶解样品，但不能与样品发生反应。

2.与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。

3.粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。

4.应与所用检测器相匹配。例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。

5.容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜等。在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。2025/1/118高效液相色谱法流动相组成：底剂（烷烃）+有机极性调节剂

例：正己烷或庚烷+氯仿---影响k的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性↑，洗脱能力↓，k↑，tR↑

溶剂系统极性↑，洗脱能力↑，k↓，tR↓注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱硅胶吸水量↑，LSC→LLC硅胶含水量较小吸附色谱硅胶极性较大硅胶含水量>17%分配色谱硅胶失活→载体吸附的水→固定液2025/1/118高效液相色谱法第四节

化学键合相色谱法一、概述二、化学键合相三、反相键合相色谱法四、正相键合相色谱法2025/1/118高效液相色谱法一、概述

将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相。尽管选用与固定液不互溶的溶剂作流动相，但在色谱过程中固定液仍会有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击，固定相会不断流失，即使将流动相预先用固定相液体饱和或在色谱柱前加一个前置柱，使流动相先通过前置柱，再进入色谱柱，但仍难以完全避免固定液的流失。

2025/1/118高效液相色谱法续前70年代初发展了一种新型的固定相—化学键合固定相。这种固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。2025/1/118高效液相色谱法

根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。在极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小，所以极性键合相色谱属于正相色谱。弱极性键合相既可作为正相色谱，也可作为反相色谱。但通常所说的反相色谱系指非极性键合色谱。反相色谱在现代液相色谱中应用最为广泛。2025/1/118高效液相色谱法二、化学键合相化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。2025/1/118高效液相色谱法键合相可分为四种键型：A硅酸酯型（=Si-O-C=）键合相

将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成（=Si-O-C=）键合相。反应生成单分子层键合相。一般用极性小的溶剂洗脱，分离极性化合物。B硅氮型（=Si-N=）键合相

如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化），再与各种有机胺反应，可以得到各种不同极性基因的键合相。可用非极性或强极性的溶剂作为流动相。2025/1/118高效液相色谱法C硅碳型（=Si-C=）键合相将硅胶表面氯化后，使Si-Cl键转化为Si-C键。在这类固定相中，有机基团直接键合在硅胶表面上。D硅氧烷型（=Si-O-Si-C=）键合相

将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的键合相。2025/1/118高效液相色谱法三、反相键合相色谱法

在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称ODS或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。2025/1/118高效液相色谱法吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。

2025/1/118高效液相色谱法四、正相键合色谱法

在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。2025/1/118高效液相色谱法

一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比k值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。2025/1/118高效液相色谱法化学键合色谱具有下列优点：

A.适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。

B.由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。2025/1/118高效液相色谱法续前C.键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。D.固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。2025/1/118高效液相色谱法1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用

固定液——极性→NLLC

固定液——非极性→RLLC3．正相色谱——固定液极性>流动相极性（NLLC）

极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱——固定液极性<流动相极性（RLLC）

极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分液液分配色谱法（LLC）2025/1/118高效液相色谱法（一）常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面

1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）

2．特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱4、化学键合固定相2025/1/118高效液相色谱法（二）反相键合相固定相1．分离机制：疏溶剂理论正相——流动相与溶质排斥力强，作用时间↑，k↑，组分tR↑

反相——流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓，k↓，组分tR↓2．固定相：极性小的烷基键合相

C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性>固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）

例：水+甲醇，乙腈，THF2025/1/118高效液相色谱法4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）（三）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相3．流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂

例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇2025/1/118高效液相色谱法4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6．适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性分析极性大物质、糖类等2025/1/118高效液相色谱法第五节

离子交换色谱法一、原理二、固定相三、流动相四、离子色谱法ion-exchange

chromatograph2025/1/118高效液相色谱法

离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，因此应用范围较广。

2025/1/118高效液相色谱法一、原理

离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：

阳离子交换：阴离子交换：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A2025/1/118高效液相色谱法对于阳离子交换树脂，一价离子的选择性顺序为：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二价离子的顺序为：

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+对于阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-

＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－2025/1/118高效液相色谱法二、固定相

作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分（见下表）表10-2离子交换剂上的官能基2025/1/118高效液相色谱法

常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：1.多孔型离子交换树脂它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物，直径约为5～20μm，有微孔型和大孔型之分2.薄膜型离子交换树脂

它是在直径约为30μm的固体情性核上，凝聚1～2μm厚的树脂层。3.表面多孔型离子交换树脂

它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。2025/1/118高效液相色谱法4.离子交换键合固定相它是用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。它也分为两种类型。一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。另一种是键合微粒载体型，它的载体是多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子交换固定相，它的优点是机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。2025/1/118高效液相色谱法三、流动相离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。但无论属于哪种情况，只要电离度增大，就会使样品的保留值增大。

2025/1/118高效液相色谱法四、离子色谱法

离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号淹没而无法检测。为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术：2025/1/118高效液相色谱法续前他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离柱后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：2025/1/118高效液相色谱法R+－OH＋H+Cl-→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl-→M+OH－＋R+－Cl-

由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2.6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。

2025/1/118高效液相色谱法续前在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。由于抑制柱要定期再生，而且谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。后来，Frits等人提出采用非抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·L-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。2025/1/118高效液相色谱法1.离子色谱法原理离子色谱原理，与传统离子交换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。2025/1/118高效液相色谱法2.离子色谱具有以下优点（1）分析速度快

可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高

在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2025/1/118高效液相色谱法3.离子色谱法装置：2025/1/118高效液相色谱法第六节

尺寸排阻色谱法一、原理二、固定相三、流动相size-exclusionchromatograph2025/1/118高效液相色谱法

尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。

2025/1/118高效液相色谱法尺寸排阻色谱具有其他液相色谱所没有的特点：

（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器。（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。2025/1/118高效液相色谱法一、原理

尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学惰性多孔物质——凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。其渗透过程模型见图20-7。2025/1/118高效液相色谱法2025/1/118高效液相色谱法

二、固定相

排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。

1.软性凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。

2025/1/118高效液相色谱法2.半刚性凝胶如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）