第十一章 分子生物学技术的临床应用课件

第十一章分子生物学技术的临床应用第十一章分子生物学技术的临床应用

第十一章分子生物学技术的临床应用

1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型

1990年人类基因组计划正式启动

2001年2月科学家宣布完成人类基因组的全部序列图第十一章分子生物学技术的临床应用第十一章分子生物学技术的临床应用

分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊断，也能确定个体对疾病的易感性，判别致病基因携带者并对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断•

分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组成部分第十一章分子生物学技术的临床应用第十一章分子生物学技术的临床应用第十一章分子生物学技术的临床应用第一节标本来源

第二节分子生物学技术在病原生物基因组相关疾病研究和诊断中的应用

第三节分子生物学检验技术在疾病研究和诊断中的应用第十一章分子生物学技术的临床应用第一节标本来源

第十一章分子生物学技术的临床应用DNA或RNA

来自外周血、体液、分泌物和组织如毛发、皮肤、肌肉、器官、肿瘤组织等产前基因诊断标本：羊水细胞（16周～20周）绒毛膜细胞（7周～9周）第一节标本来源

第十一章分子生物学技术的临床应用第二节分子生物学技术在病原生物基

因组相关疾病研究和诊断中的应用

第十一章分子生物学技术的临床应用第二节分子生物学技术在病原生物基因组相关疾病研究和诊断中的应用

一、感染性疾病的诊断和治疗监测

二、耐药监测与分子流行病学调查三、医院获得性感染的监测与控制

第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测

分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断和治疗过程中的疗效监测等检测核酸分子或蛋白质分子目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核病、病毒性肝炎、艾滋病、SARS、人禽流感等第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测

（一）结核分枝杆菌（二）乙型肝炎病毒

（三）人类免疫缺陷病毒（四）SARS冠状病毒（五）人禽流感病毒第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测

（一）结核分枝杆菌1.生物学特性与致病性2.基因组特点3.结核分枝杆菌核酸的检测第十一章分子生物学技术的临床应用（一）结核分枝杆菌1.生物学特性与致病性结核分枝杆菌复合群包括人结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，其中前三者对人类致病人型结核分枝杆菌感染的发病率最高一、感染性疾病的诊断和治疗监测

第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测结核分枝杆菌生长缓慢，增殖一代需15～20小时，生长成可见菌落一般需4～6周在组织细胞内大量繁殖引起炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及菌体成分诱发的机体免疫损伤第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测

2.基因组特点共价封闭环状结构标准株结核分枝杆菌基因组全长4.4kb,包含4000个蛋白质编码基因和50个RNA编码基因

第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测

(1)重复序列：如IS6110，仅存于结核分枝杆菌复合群细菌染色体上长1355bp的重复插入序列，具有复合群特异性

(2)蛋白质编码基因

(3)rRNA基因：每个细胞约含有103～104个rRNA，含有结核分枝杆菌高度保守的序列，也有分枝杆菌种特异性序列第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测3.结核分枝杆菌核酸的检测实验室检查手段主要包括标本直接涂片染色镜检、分离培养鉴定以及血清学抗原检测方法分子生物学理论和技术已经用于分枝杆菌的分子结构和功能的研究中，并开始用于临床菌种和耐药株的鉴定及监测第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测PCR菌种鉴定法PCR直接测序鉴定法PCR-DNA探针鉴定法PCR-基因芯片法(1)结核分枝杆菌菌种鉴定：第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测(2)药物敏感性试验与耐药基因检测：缩短培养和鉴定的时间，及时指导临床选药药物敏感性试验直接检测耐药基因第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测

（二）乙型肝炎病毒

1.生物学特性及致病性2.乙型肝炎病毒核酸的检测

3.变异株与耐药突变检测第十一章分子生物学技术的临床应用1.生物学特性及致病性HBV对外界环境的抵抗力较强，且传染性较强输血或注射是重要的传播途径HBV感染后潜伏期约2～6个月，HBVDNA在肝细胞内以游离DNA和整合到宿主细胞染色体的方式存在HBV分为8个基因型，A～H型一、感染性疾病的诊断和治疗监测

第十一章分子生物学技术的临床应用2.乙型肝炎病毒核酸的检测

（1）荧光定量PCR技术：测定HBV病毒载量

HBVDNA

107拷贝/毫升，提示病毒复制活跃

HBVDNA<103拷贝/毫升、HBeAg转为阴性，ALT

正常的病人预后相对较好一、感染性疾病的诊断和治疗监测

第十一章分子生物学技术的临床应用

（2）支链DNA（bDNA）技术：一种核酸探针杂交标志信号放大技术。优点：稳定性和重复性较好，结果准确，操作简单，将待测病毒裂解释放核酸后变性为单链，即可进行检测。缺点：敏感性较低、检测范围窄而不适用于低水平病毒的检测。一、感染性疾病的诊断和治疗监测

第十一章分子生物学技术的临床应用3.变异株与耐药突变检测

HBV可能发生自然变异HBV在人体活疫苗接种和抗病毒治疗等压力下发生变异HBV基因组的变异常引起病毒生物学特性的改变，从而导致HBV感染发病机制的变化、血清学检测指标的改变以及免疫逃逸，给乙型肝炎的诊断和治疗带来困难一、感染性疾病的诊断和治疗监测

第十一章分子生物学技术的临床应用HBV耐药突变类型及其核苷酸、氨基酸变化第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测

（三）人类免疫缺陷病毒1.形态结构与致病性2.HIV核酸检测第十一章分子生物学技术的临床应用1.形态结构与致病性HIV根据血清学反应和病毒核酸序列分为

HIV-1型、HIV-2型HIV结构分为包膜、核心一、感染性疾病的诊断和治疗监测

第十一章分子生物学技术的临床应用HIV直接或间接损伤CD4+T细胞HIV抑制抗原递呈细胞功能HIV诱发自身免疫性疾病及诱导细胞凋亡HIV导致CD8+T细胞丧失抗病毒活性等一、感染性疾病的诊断和治疗监测

HIV感染以侵犯CD4+T细胞为主第十一章分子生物学技术的临床应用原位杂交PCRNASBA技术bDNA技术荧光定量RT-PCR技术一、感染性疾病的诊断和治疗监测

2.HIV核酸的检测的分子生物学方法第十一章分子生物学技术的临床应用（四）SARS冠状病毒

从SARS病人体内分离到的冠状病毒与任何以往确定特征的冠状病毒关系不密切，且该病毒的有限区域的复制酶（rep）基因序列与其它冠状病毒明显不同，因而被称为SARS相关冠状病毒。一、感染性疾病的诊断和治疗监测

第十一章分子生物学技术的临床应用SARS相关冠状病毒的检测

WHO推荐SARS-CoV特异性检测方法：分子生物学检测免疫学检测细胞分离培养一、感染性疾病的诊断和治疗监测

第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测免疫学方法难以在感染的窗口期对病毒感染进行早期检测细胞培养所需时间较长，分离阳性率不高PCR方法可以确诊早期疑似病人，但PCR试验阴性并不能说明没有SARS-CoV感染第十一章分子生物学技术的临床应用（五）人禽流感病毒

人禽流行性感冒（简称人禽流感）是由禽甲型流感病毒某些亚型的毒株引起的急性呼吸道传染病，感染者大多因多脏器功能衰竭而死亡。一、感染性疾病的诊断和治疗监测第十一章分子生物学技术的临床应用（五）人禽流感病毒一、感染性疾病的诊断和治疗监测

1.病原学特征及致病性2.人禽流感病毒的检测第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测1.病原学特征及致病性禽流感病毒属甲型流感病毒，基因组为单股负链RNA依外膜血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可分为15个H亚型和9个N亚型感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情最重第十一章分子生物学技术的临床应用一、感染性疾病的诊断和治疗监测2.人禽流感病毒的检测

(1)病毒核酸检测：RT-PCR技术从病人呼吸道标本中检测禽流感病毒亚型特异性H抗原基因。

(2)病毒抗原蛋白质分子检测：取病人呼吸道标本采用免疫荧光法检测甲型流感病毒核蛋白抗原及禽流感病毒H亚型抗原。第十一章分子生物学技术的临床应用二、耐药监测与分子流行病学调查（一）耐药突变检测（二）分子流行病学调查第十一章分子生物学技术的临床应用二、耐药监测与分子流行病学调查PCR-RFLPSSCPDGGEPCR-反向斑点杂交技术DNA序列分析芯片技术等（一）耐药突变检测第十一章分子生物学技术的临床应用二、耐药监测与分子流行病学调查追踪和控制传染源及可能的传播途径确定同一病人反复感染是源于复发或再感染明确某一菌株是否与某些临床表现相关，从而发现其特殊的传播和致病机制（二）分子流行病学调查第十一章分子生物学技术的临床应用二、耐药监测与分子流行病学调查1.IS6110RFLP2.间隔区寡核苷酸探针分型技术

第十一章分子生物学技术的临床应用二、耐药监测与分子流行病学调查

1.IS6110RFLPIS6110重复序列探针被称为结核分枝杆菌复合群分型的金标准。检测步骤：细菌培养提取基因组DNAPvuⅡ限制性酶水解Southern印迹IS6110探针杂交第十一章分子生物学技术的临床应用二、耐药监测与分子流行病学调查

2.间隔区寡核苷酸探针分型技术直接重复序列只在结核分枝杆菌复合群细菌染色体的某一位置出现，由多个高度保守的36bp的序列组成，其间被高度保守的34～41bp非重复的短序列间隔开36bp重复序列出现的次数和某些间隔序列的出现或消失在不同菌株表现出可变性第十一章分子生物学技术的临床应用三、医院获得性感染的监测与控制

医院感染，又称院内感染，是指病人入院时尚未感染，也不处于感染的潜伏期，而是在入院以后（通常指入院48小时后）引起的感染，以及在医院内获得但在出院后才发生的感染第十一章分子生物学技术的临床应用第三节分子生物学检验技术在疾病研究

和诊断中的应用第十一章分子生物学技术的临床应用第三节分子生物学检验技术在疾病研究和诊断中的应用一、单基因遗传性疾病的基因诊断三、多基因病的分子诊断四、在线粒体遗传病中的应用五、在白血病中的应用六、分子生物学在HLA配型中的应用二、单基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用一、单基因遗传性疾病的基因诊断

（一）单基因疾病中常见的分子异常

（二）遗传性疾病基因诊断的策略

（三）基因诊断所采用的技术

（四）遗传标志的选择

（五）间接诊断的局限第十一章分子生物学技术的临床应用（一）单基因疾病中常见的分子异常由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息改变基因突变主要包括三大类：点突变、片段性突变和动态性突变一、单基因遗传性疾病的基因诊断

第十一章分子生物学技术的临床应用一、单基因遗传性疾病的基因诊断

1.点突变2.片段性突变3.动态性突变

第十一章分子生物学技术的临床应用

1.点突变点突变：DNA分子中单个碱基的替换终止密码子突变：点突变导致提前产生终止密码，或终止密码突变而编码一个氨基酸使肽链延长一、单基因遗传性疾病的基因诊断

第十一章分子生物学技术的临床应用一、单基因遗传性疾病的基因诊断各种点突变所造成的后果：

蛋白质分子量改变蛋白质合成量下降无蛋白质合成第十一章分子生物学技术的临床应用2.片段性突变核苷酸的丢失和增多缺失：基因中碱基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用3.动态性突变

以三核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。脆性X综合征：CGG重复。少年脊髓型共济失调：GAA重复。

……一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用一、单基因遗传性疾病的基因诊断（二）遗传性疾病基因诊断的策略1.直接诊断策略2.间接诊断策略第十一章分子生物学技术的临床应用（二）遗传性疾病基因诊断的策略1.直接诊断策略 基因诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。直接诊断是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。

一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用2.间接诊断策略

间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体是否存在双亲同源染色体中的致病染色体间接诊断不是寻找DNA的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标志的多态性估计被检者患病的可能性一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用连锁分析(linkageanalysis):

是通过用一系列覆盖密度适当的遗传标志在先证者家系中进行分析，从而找到与某一遗传标志紧密连锁的致病基因，并确定该基因在染色体上的位置一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用（三）基因诊断所采用的技术一、单基因遗传性疾病的基因诊断2.基因表达异常的检测3.间接诊断所采用的技术1.直接诊断所采用的技术第十一章分子生物学技术的临床应用1.直接诊断所采用的技术Southern印迹技术多重PCR技术PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）等位基因特异性寡核苷酸（ASO）DNA芯片技术（DNAchip）单链构象多态性（SSCP）变性梯度凝胶电泳（DGGE）DNA序列分析（DNAsequencing）一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用2.基因表达异常的检测定量PCR技术DNA结合染料技术水解探针技术技术杂交探针技术一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用3.间接诊断所采用的技术

间接诊断就是分析DNA的遗传标志的多态性（1）限制性片段长度多态性（RFLP）第一代DNA的遗传标志，具双等位基因多态性，所含信息量有限。检测方法：Southern印迹技术、PCR-RFLP。一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用

（2）小卫星序列串联重复可变数目（VNTR），以6～70bp为单位，可重复数次至数十次，以串联形式排列，构成数量可变的串联重复序列。等位基因常常达10个以上，信息量比RFLP大得多。检测方法：Southern印迹技术、PCR技术。一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用一、单基因遗传性疾病的基因诊断

（3）微卫星序列

以2～6bp为单位，重复次数可达几十次，又称短串联重复序列(STR)，在基因组中出现的数目和频率不同，分布广泛，具高度多态性，属于第二代的遗传学标志。检测方法：PCR技术、基因扫描。一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用（4）单核苷酸多态性(SNP)

第三代DNA的遗传标志，其多态性仅表现为单个核苷酸的变异，在人类基因组中的数目可达300万个，由3～4个相邻的标志便可构成8～16种单倍型，是一种信息量非常大的标志系统。检测方法：DNA芯片技术。一、单基因遗传性疾病的基因诊断一、单基因遗传性疾病的基因诊断第十一章分子生物学技术的临床应用（四）遗传标志的选择

选择离致病基因最近的遗传标志遗传标志离致病基因的距离越远，二者间发生重组的可能性越大，二者间距离为1cM(106bp)时，发生重组的概率为1%一、单基因遗传性疾病的基因诊断

第十一章分子生物学技术的临床应用（五）间接诊断的不确定性遗传标志所带的信息有限新突变基因重组家系成员不够完整一、单基因遗传性疾病的基因诊断

第十一章分子生物学技术的临床应用二、单基因病的分子诊断单基因遗传病是由于某一基因结构的变化或由其而引起的基因表达异常而导致的疾病第十一章分子生物学技术的临床应用（一）血友病A的分子诊断（二）珠蛋白合成障碍性贫血的分子诊断二、单基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用二、单基因病的分子诊断1.凝血因子Ⅷ基因的主要遗传缺陷2.FⅧ基因的直接检测（22号内含子倒位检测）3.FⅧ基因连锁分析（FⅧ基因st14位点多态性检测）（一）血友病A的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用血友病A1.凝血因子Ⅷ基因的主要遗传缺陷主要为点突变和基因缺失 缺失 169种

插入 28种

点突变 347种第22号内含子倒位:40%～50%重型HA二、单基因病的分子诊断第22号内含子倒位的机制二、单基因病的分子诊断11kb/12kb/12kb/11kb/12kb2.FⅧ基因的直接检测——22号内含子倒位检测二、单基因病的分子诊断长距离PCR扩增22号内含子3.FⅧ基因连锁分析——

FⅧ基因st14位点多态性检测B/A/B/CB/CC/DC/B/D二、单基因病的分子诊断PCR检测VNTR（st14）位点进行家系连锁分析第十一章分子生物学技术的临床应用血红蛋白异常包括两大类结构变异：珠蛋白链上氨基酸序列发生改变如镰状细胞贫血珠蛋白链合成障碍：一部分珠蛋白链合成过多，一部分珠蛋白链合成过少甚至不能合成，如地中海贫血二、单基因病的分子诊断（二）珠蛋白合成障碍性贫血的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用珠蛋白合成障碍性贫血的遗传缺陷（1）α珠蛋白合成障碍性贫血主要基因缺陷：α珠蛋白基因缺失检测方法：Southern印迹技术、PCR

二、单基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用α0珠蛋白合成障碍性贫血（α0--SEA型）基因缺失检测引物部位

二、单基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用（2）β珠蛋白合成障碍性贫血基因缺陷：点突变和移码突变检测方法：基因突变检测方法、PCR二、单基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用点突变丧失了Mstll酶切位点RFLP检测β珠蛋白基因点突变二、单基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用三、多基因病的分子诊断

多基因病：多个基因参与某一疾病的发生多基因病具一定的遗传因素，家庭发病率高于人群发病率，但是疾病的产生都以一定的环境条件为诱因，遗传因素在其中所起作用程度各异第十一章分子生物学技术的临床应用

多基因病中的遗传因素是若干个易感基因微小作用的累加，某一易感基因结构的变化不足以导致疾病的产生人类基因组多态性是多基因病基因诊断的基础，易感基因多态性的检测能帮助我们理解多基因病发生的机制，有助于对疾病的诊断和分类三、多基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用高血压候选基因多态性分析在EH中的应用前景

临床分型靶器官损伤个体化治疗三、多基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用原发性高血压相关基因的检测(1)ACE基因I/D多态性检测(2)AGT基因Thr174Met突变检测三、多基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用ACE基因多态性与高血压靶器官损伤疾病研究报告数IDDD冠心病 30 +11%+32%心肌梗死15 +12%+39%脑卒中 5+22%+94%高血压肾病19 +10%+53%糖尿病肾病11 +40%+56%*与II型相比，DD型和ID型发生上述疾病的危险性增高程度三、多基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用AGT基因研究目的：观察AGT基因分型与限钠盐摄入及减轻体重后的血压变化和高血压发病率间的关系对象：1509例基因分析：AGT基因G-A多态性结果：三年后高血压发生率（%）

对照组限盐组减轻体重组

AA型452825GG型324132

三、多基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用

基因多态性检测与个体化治疗

根据病人易感基因的多态性设计有效的、个体化的治疗方案，以达到最佳的治疗效果三、多基因病的分子诊断第十一章分子生物学技术的临床应用四、在线粒体遗传病中的应用（二）线粒体基因的检测

（三）常见的线粒体疾病(一)线粒体遗传病的遗传特征第十一章分子生物学技