DB33T 2287-2020 罗氏沼虾双顺反子病毒-1 检测规程　

DB33罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测规程DetectionprotocolsforMacrobrachiumrosenbergiidicistrovirus-1浙江省市场监督管理局发布I本标准按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规本标准主要起草人：潘晓艺、沈锦玉、蔺凌云、姚嘉本标准的发布机构提请注意如下事实，声明符合本标准时，可能涉及到6.10-6.11中引物与《罗氏1罗氏沼虾双顺反子病毒-1检测规程子病毒-1检测程序的构成、试剂和材料、器材与设备、操作步骤和结本标准适用于罗氏沼虾双顺反子病毒-1的检测及关联疾病的流行病学调查、诊断和监GB/T6682-2008分析实验室用水规格SC/T7103水生动物产地检疫采SC/T7202.1斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分：压片显罗氏沼虾双顺反子病毒-1Macrobrtaihuvirus，MrTV），属于小R30nm的二十面体球形颗粒，核酸类型为单股正链RNA，长度约10.3kb。其主要侵染罗氏沼虾幼体甲壳下上皮组织和神经节，造成肝脏和结缔组织出现强嗜碱性细胞质包涵体。4缩略语DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicacidNTP：脱氧核苷三磷酸（DeoxyribonucleosidetDB33/T2287—2020dTTP:脱氧胸苷三磷酸(Deoxythymidinetriphosphate)M-MLV:莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavi1样品的准备(见8.1)1样品的准备(见8.1)2RNA模板的提取(见8.2)3.1cDNA合成(见8.3.1)4琼脂糖电泳(见8.4)(见9.1)4实验有效(见9.1)3.3第二轮PCR扩增(见8.3.3)3.2第一轮PCR扩增(见8.3.2)4结果判定(见9)236.3RNA酶抑制剂：40U/L20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。6.4M-MLV逆转录酶：200U/L20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。6.7TaqDNA聚合酶：5U/L20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。6.8DNA分子量标准：DNAMarkerDL200020℃保存。6.12阳性对照为已知受MrTV感染且RT-PCR结果显示强阳性的虾组6.13阴性对照为已知未受MrTV感染且RT-PCR结果显示阴性的虾组织87.5低温高速离心机：温度可设置范围0℃~40℃,最高可设定转速≥15000转/分钟。4鲜活幼体、仔虾及体长在3cm以下稚虾个体样品约30mg～50mg(去掉稚虾眼)；成虾取约30mg~），8.3RT-PCR操作对每一份样品，在一支无RNA酶的0.2mLPCR管中，加入1.5L10M引物MrTV572R1，2.5L无 L5×M-MLV逆转录酶缓冲液、1LRNasin(40U/L)、0.5L10mmol/LdNTPs、0.5LM-MLV逆转录酶(200U/L)，42℃保温1小时，以合成cDNA，然后于80对每一份样品，取一支无RNA酶的0.2mLPCR管，加入2.5L10×PCR缓冲液、0.5L10mmol/L18.5L无RNA酶水和2L8.3.1步骤的逆转0.5L10M引物MrTV472F2、0.5L10M引物MrTV472R2、1LTaqDNA聚合酶(5U/L)、41.0L无RNA酶水，最后加入1L8.3.2步骤的扩增产物5用1×电泳缓冲液（1×电泳缓冲液的配制按附录A中A.3进行）配制2%的琼脂糖凝胶（含0.5g/mL缓冲液刚好淹没胶面，将5LPCR扩增产物和1L6×载样缓冲液（6×载样缓冲液配制按附录A中A.5进行）混匀后加入样品孔，在电泳时设立DNA分子量标准。5V/cm电泳约0.5小时，当溴酚蓝到达底部9结果判定照在572bp处无任何条带，以无RNA酶水为模板设立的空白对照无任何条带第二轮PCR扩增：阳性对照在472bp处会有特定条带出现；阳性样品在在472bp处无任何条带，以无RNA酶水为模板设立的空白对照无任何条带出3．逆转录产物成份抑制PCR。阴性对照组或空白对照组在第一二次PCR扩增后在472bp处有条带出62.检查逆转录和PCR试剂，重新合成性对照和样品出现较多杂带或明显的1．未注意低温操作，使PCR出现非特2．酶活性变化、dNTPs浓度变化或107试剂配制方法在无RNA酶的玻璃量筒中配制，混匀，按1.0mL/支分装于无RNA酶的1.5mL微量离心管中，保存于-20℃待用。A.2无RNA酶的水盖上瓶塞，用磁力搅拌器于37℃剧烈搅拌12小时，按50mL/瓶～200mL/瓶分装于无瓶内，透气高压蒸汽灭菌15分钟，冷却A.31×电泳缓冲液Tris4.A.56×载样缓冲液8外源性的RNA酶污染是指来自于水、玻璃制品、塑料器皿、电泳槽、操作人员和微生物等。可通过DEPC、氯仿、干热烘烤等方法来消除。本附录主高压蒸汽灭菌15分钟。不能用DEPC处理的试剂(如含有Tris的溶液)或者不能经高压蒸汽灭菌的试剂，应使用经DEPC处理的水配制，然后经无RNA酶的0.22m微孔滤膜过滤除菌。玻璃器皿洗净后，在180℃烘烤4小时可彻底除去器皿上沾污的RNA酶。不得用任何在180℃下可DEPC的水中浸泡12小时，然后经高压蒸汽灭菌，最后烘干。可购买无RNA酶的一次性塑料制品，如塑料离心管、PCR管、枪沫、落尘带入RNA酶的污染，必要的情况下戴口罩和实验帽，或在超净工作台中进行所有接触RNA的试剂和材料都应保持无菌，一旦有微生物污9罗氏沼虾双顺反子病毒-1套式RT-PCR检测产物序列4524ATGTAGAGCGTGGAGGAGTAAAAGTAGATATAGTTATTTGCGAATTAGGTGCTTCTATTTMrTV572F14582CGGCTCGTAAGGGTATAGTGTCTTATTTTCCGCGCGTGAATGAGTTGTCTAGTCTTAGTG4642GTTTAATGGCTAACGGTGAGTTAAGAGTATTTACAACAACCAATTTTGGTAAATTCAATT4702TTCTAATTCCCAAAGATTCTTCTGCTATCTTTACTAGGGTTGTGGATCATGTAGAGTCTA4762GATCACCAGAAGGTTCTTCGTATTATATAAGGCAAGGTTTTGAAGCAAAGGGAAATTCTG4822TTCATGGTGATTGTTGTGCTCCCTACATAATGTTTAATCCGTCTTCGCGTGCTAAGATTG4882TGGGTCTCCATTGTGCTGGATTTGCTCAGACATCTCGAGTGTTTGCTCAAATGATAACGC4942AGGAGGATATTGCTA