2025届高考生物二轮复习讲义微专题+++++基因工程

基因工程知识构建1．限制酶的选择技巧(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)(3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。2．基因表达载体的构建过程(如图)3．Cre/LoxP重组酶系统(1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。(2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。(3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。4．CRISPR/Cas9基因编辑CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。5．In－Fusion技术In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。

真题演练1．(2024·全国甲，38节选)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在____________________________________________________________________________________________________________________________________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。2．(2023·全国乙，38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是________________________________________________________________________________________________________________________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。3．(2022·福建，13节选)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。4．(2024·新课标，35节选)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题：(1)限制酶切割的化学键是__________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________________________________________________________________________。5．(2024·湖南，21节选)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图a。图b是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。(1)研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图a所示结构中获取pL，首先选用________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图c。由此可知：三种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中______________的诱导作用最强。(2)现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。6．(2023·海南，20节选)我国开发了一种新型基因递送系统(切—浸—生芽，简称CDB法)。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。则：(1)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)已知某酶(PDS)缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体(含有绿色荧光蛋白标记基因)，利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B。据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是________________________，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是________________________________________________________________________，依据是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。

模拟练1．研究人员将靛蓝色素酶基因(IDG)与启动子PTL12(棉纤维细胞特异启动子)相连以构建基因表达载体(如图，KpnⅠ、HindⅢ、BamHⅠ、PstⅠ代表不同限制酶，图中质粒上酶的位置为其对应的酶切位点)，并最终培育出能在棉纤维细胞中表达靛蓝色素酶的彩色棉新品种。本研究中将IDG与启动子PTL12结合的主要目的是________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。过程①②都使用KpnⅠ切割质粒，目的是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。2．(2024·天津宁河区高三一模)蓝细菌中的ictB蛋白能高效转运和浓缩CO2，从而提高细胞光合速率。我国科学家构建了叶片特异性启动子Cab(叶绿体捕光色素蛋白Cab基因启动子)驱动的蓝细菌ictB基因表达载体，并通过农杆菌转化法获得了转ictB基因水稻，大大提高了水稻的产量。在ictB基因表达载体的构建中，含Cab启动子和ictB基因的重组DNA分子和Ti质粒的酶切位点如图1所示。请回答下列问题：(1)为使重组DNA分子能定向插入T－DNA中，可用PCR的方法在重组DNA分子两端添加限制酶识别序列，据图可知，M端添加的序列所对应的限制酶是________，N端添加的序列所对应的限制酶是________。添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要______种酶。(2)将农杆菌液浸泡过的水稻愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需加入____________进行筛选，最终获得多个水稻株系a1、a2、a3、a4。对a1～a4四个水稻株系的ictB蛋白表达量进行测定，结果如图2，其中a4株系ictB蛋白表达量较低的原因可能是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。检测应选用的植物器官是______，原因是____________________________________________________________________________________________________________________________。3．随着土壤盐渍化(主要是Na＋引起)不断加剧，提高耐盐性已成为研究和改良作物的重要方向。从高盐环境中吸收K＋可维持细胞内K＋/Na＋稳态，从而提高植物的耐盐性。H是细胞膜上的一种K＋转运蛋白，B蛋白可以增强H的功能。为探究作用机理，研究人员构建了两个分别含有CFP－B和YFP－H融合基因的表达载体。CFP和YFP分别是青色荧光蛋白基因和黄色荧光蛋白基因。为了获得含CFP－B的表达载体，选择了已经包含CFP的载体p1300－CFP。相关信息如图所示。请回答下列问题：(1)为将B基因连入CFP基因，需使用两端带有酶切位点序列的引物扩增B基因，优先选择的酶切位点是________________，理由是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)据此，研究人员使用的两条引物序列分别为5′－XXXXXXNNATGGCCGGC－3′和5′－YYYYYYCTACTCAGA－3′。X和Y分别代表(1)选择的酶切位点，N代表任意碱基的核苷酸。第一条引物中NN的作用是______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。第二条引物与图中B基因末端序列不相同的原因是____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。用同样的方法获得了含YFP－H融合基因的表达载体。4．通过体内同源重组可以进行靶向基因敲除，原理如图1所示。同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，研究基因的功能。图2是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物。回答下列问题：限制酶EcoRⅠBamHⅠHindⅢXmaⅠ识别序列和切割位点↓5′—GAATTC—3′↓5′—GGATCC—3′↓5′—AAGCTT—3′↓5′—CCCGGG—3′(1)据图1分析，与传统转基因技术相比，体内同源重组具有的特点是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)图2过程①中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________、________限制酶的识别序列；过程⑤中，设计两种引物时需在引物5′端分别添加________基因两端的同源序列。(3)图2过程⑦中，在含有____________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加____________。5．PMP22基因在人基因组中有多个拷贝，表达产生的PMP22蛋白在人髓鞘细胞中不可或缺，但PMP22蛋白过量可引发腓骨肌萎缩症(CMT1A)，科研人员希望利用CRISPR/Cas9基因编辑系统治疗CMT1A。回答下列问题：(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统原理如图1所示，Cas9蛋白可切割特定部位的DNA双链，造成DNA损伤，一次切割过程中会产生______个游离的磷酸基团。机体修复DNA损伤时，可能会改变碱基序列。图中gRNA的作用是___________________________________。(2)科研人员本来的基因编辑方案是将gRNA结合位点设计在PMP22基因内部，后改为如图2所示的方案，该方案比起原方案的优点是___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)科研人员希望在人髓鞘细胞中表达CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建的基因表达载体如图3所示。①在对gRNA对应的DNA片段进行PCR扩增时，需要在上游和下游引物的5′端分别添加碱基序列________________和________________，保证DNA片段定向插入。②基因表达载体上，除了图示序列和标记基因外，还需要的序列是________。6．(2024·青岛高三二模)某种雄性不育水稻是由野生型水稻的核基因M突变为m所致，科研团队构建转基因智能不育系的思路是将育性恢复基因OsNP1(在原始生殖细胞中表达)、花粉失活基因ZM－AA(在花粉中表达)两个基因一起构建重组Ti质粒。然后通过农杆菌转化法将目的基因导入愈伤组织细胞，从转基因后代中筛选m位点是纯合但两个转基因位点是杂合的可育植株。(1)图1为已导入ZM－AA基因的重组Ti质粒，图2为OsNP1基因和相应的酶切位点，其中A链为转录模板链。为使OsNP1基因与图1中Ti质粒正确连接来构建基因表达载体，应选择的酶有______________________________；采用PCR技术扩增图2中的OsNP1基因时，会出现长、中、短三种长度的单链，一个OsNP1基因在第n次循环中新合成的短链数为________。(2)重组Ti质粒中的新霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因的具体作用分别是________________________________________________________________________________________________________________________________________________、________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)若使两个基因分别在不同的细胞中表达，需将两个基因分别与______________________________________________________________________________________________________________________________________________重组在一起。

答案精析真题演练1．避免目的基因和质粒的反向连接、防止目的基因和质粒的自身环化T4DNA连接酶2．终止子启动子RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来3．正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列)；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)4．(1)磷酸二酯键不破坏N基因，使M1与M2之间有启动子、N基因、终止子，能保证N基因正常表达(2)C－G、A－T、U－A5．(1)HindⅢ、BamHⅠ交链格孢(2)利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL解析(1)根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得启动子pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图c的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。(2)欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。6．(1)农杆菌细胞内含有Ti质粒，Ti质粒中的T－DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起(2)荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根观察幼苗是否表现出白化特征PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除模拟预测1．PTL12是棉纤维细胞特异启动子，将IDG与特异启动子PTL12结合可以使IDG基因在棉纤维细胞中特异表达形成相同的黏性末端，使PTL12片段能与IDG按设计方向正确连接，保证IDG的正确表达2．(1)BglⅠEcoRⅤ4(2)潮霉素a4水稻株系中没有导入目的基因或目的基因未表达叶片Cab启动子是叶片特异性启动子，它使ictB基因只能选择性地在叶片中表达解析(1)据图1可知，重组DNA分子中有BamHⅠ的酶切位点，故不能选择BamHⅠ，又因为Sau3AⅠ也可识别BamHⅠ的酶切位点，故也不能选择Sau3AⅠ，又由于SpeⅠ能切割Cab启动子，也不能选择，故只能选择BglⅠ和EcoRⅤ，再根据启动子的方向可知，M端添加的序列所对应的限制酶是BglⅠ，N端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅤ；添加了限制酶识别序列的重组DNA分子与Ti质粒的重组过程共需要4种酶，分别是BglⅠ、EcoRⅤ、DNA连接酶和