生物化学生物化学第一章蛋白质

第五节蛋白质结构与功能的关系生物化学生物化学第一章蛋白质一、一级结构与功能的关系生物化学生物化学第一章蛋白质

蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。生物化学生物化学第一章蛋白质1、同功能蛋白质一级结构的种属

差异与分子进化

生物化学生物化学第一章蛋白质同功能蛋白质：不同生物体中表现同一功能的蛋白质，又称同源蛋白质。生物化学生物化学第一章蛋白质对比不同生物的同源蛋白质的氨基酸序列可以发现，它们长度相同或相近，而且许多位置的氨基酸是相同的。这些相同的氨基酸残基称为不变残基。不变残基对于同源蛋白的功能是必需的。生物化学生物化学第一章蛋白质其它对于不同种属有相当大变化的残基称为可变残基。根据可变残基能推测生物种属间在系统发生上的联系。同源蛋白质的氨基酸序列的相似性称为顺序同源性。生物化学生物化学第一章蛋白质

生物与人不同的AA数目黑猩猩0

恒河猴1

兔9

袋鼠10

牛、猪、羊、10

狗、驴11

马12

鸡、火鸡13不同生物与人的Cytc的AA差异数目

生物与人不同的AA数目响尾蛇14

海龟15

金枪鱼21

角饺23

小蝇25

蛾31

小麦35

粗早链孢霉43

酵母44

生物化学生物化学第一章蛋白质根据细胞色素C的顺序种属差异建立起来的进化树生物化学生物化学第一章蛋白质2、一级结构的变异与分子病分子病：由于基因突变导致蛋白质一级结构发生变异，使蛋白质的生物学功能减退或丧失，甚至造成生理功能的变化而引起的疾病，称为分子病。生物化学生物化学第一章蛋白质

镰刀状红细胞贫血病生物化学生物化学第一章蛋白质正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图

-链N端氨基酸排列顺序12345678

Hb-A（正常人）Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S（患者）Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…镰刀形红细胞正常红细胞生物化学生物化学第一章蛋白质2、空间结构与功能的关系核糖核酸酶的变性与复性生物化学生物化学第一章蛋白质一级结构是空间构象的基础牛核糖核酸酶的一级结构二硫键生物化学生物化学第一章蛋白质

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性Anfinsen实验生物化学生物化学第一章蛋白质肌红蛋白与血红蛋白的结构与功能目录生物化学生物化学第一章蛋白质肌红蛋白(Mb)由153个氨基酸残基组成,血红蛋白(Hb)的α亚基有141个氨基酸,β亚基有146个氨基酸残基。MbandHb的两种亚基氨基酸残基数和序列均有变化，但它们的三级结构几乎完全相同。说明肌红蛋白和血红蛋白的α亚基和β亚基都起源于一个共同的祖先。生物化学生物化学第一章蛋白质在血红蛋白和肌红蛋白分子中与辅基血红素相连的氨基酸都是组氨酸。说明不同氨基酸序列中只有关键的氨基酸不变才能产生相同的构象，执行相同的功能。这种关键氨基酸通常提供形成蛋白质构象的必要基团。生物化学生物化学第一章蛋白质生物化学生物化学第一章蛋白质肌红蛋白和血红蛋白的每条链都含一个血红素辅基。血红素由四个吡咯环构成的原卟啉Ⅸ和一个铁离子组成。作为亚铁离子，可形成6个配位键：其中4个与卟啉与环的氮原子连接，第五个与His93相连，第六个与氧可逆结合附近有个His64辅助氧的结合。生物化学生物化学第一章蛋白质血红蛋白与氧结合的协同性肌红蛋白与血红蛋白都能与氧结合，但肌红蛋白是单体蛋白而血红蛋白是四聚体蛋白。生物化学生物化学第一章蛋白质血红蛋白氧饱和度在溶液中血红蛋白分子上已结合氧的位置数与可结合氧的位置数之比称为饱和度（saturation)。生物化学生物化学第一章蛋白质肌红蛋白氧饱和度生物化学生物化学第一章蛋白质PO2=13.33kPaPO2=2.67kPaHb释放氧Mb释放氧生物化学生物化学第一章蛋白质Mb和Hb的氧合曲线比较

生物化学生物化学第一章蛋白质Hb的输氧功能Mb的储氧功能生物化学生物化学第一章蛋白质血红蛋白与氧结合的分子机制生物化学生物化学第一章蛋白质

脱氧血红蛋白亚基间的交联键

生物化学生物化学第一章蛋白质第六节蛋白质的性质生物化学生物化学第一章蛋白质

蛋白质两性解离性质和等电点pH=pI

净电荷=0

pH<pI净电荷为正pH>pI净电荷为负PrCOOHNH3++H++OH-+H++OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+生物化学生物化学第一章蛋白质

当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectricpoint，pI）生物化学生物化学第一章蛋白质蛋白质电泳蛋白质在溶液中解离成带电颗粒，在电场中可以向与其电荷相反的电极移动，这种现象称为：电泳生物化学生物化学第一章蛋白质不同种类的蛋白质由于等电点的不同，在一个指定pH条件下所带电荷的性质和多少也不相同，加上它们分子量大小、颗粒形状的不同，因此在电场中移动的方向和速度各不相同。根据这一原理可用此方法对蛋白质进行分离和分析。生物化学生物化学第一章蛋白质1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。2）平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。+—-+生物化学生物化学第一章蛋白质

聚丙烯酰胺凝胶电泳既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。生物化学生物化学第一章蛋白质PAGE垂直平板电泳示意图低浓度浓缩胶高浓度分离胶聚丙烯酰胺凝胶电泳具有三种物理效应：①浓缩效应②分子筛效应③电荷效应生物化学生物化学第一章蛋白质生物化学生物化学第一章蛋白质生物化学生物化学第一章蛋白质蛋白质胶体性质

由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带有电荷，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。生物化学生物化学第一章蛋白质+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉生物化学生物化学第一章蛋白质蛋白质胶体性质的应用透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。

生物化学生物化学第一章蛋白质透析与超过滤简易装置生物化学生物化学第一章蛋白质蛋白质的分子量及其测定蛋白质的相对分子量很大，一般在104~106或更大。蛋白质的分子量除了根据其化学组成来测定外，主要是利用蛋白质的某些物理化学性质来测定。生物化学生物化学第一章蛋白质1、沉降速度法是利用超速离心机测定蛋白质相对分子量的一种方法。将蛋白质溶液放在超速离心机的离心管中进行超速离心。60000~80000rpm.使蛋白质分子沉淀下来，当蛋白质的分子大小和形状相同时下沉速度也会相同，在离心管中产生一个明显的界面，利用光学系统可以观察到此界面的移动，从而测定蛋白质的沉降速度。生物化学生物化学第一章蛋白质超离心法最为准确，但需昂贵的超速离心机。用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。生物化学生物化学第一章蛋白质离心机结构示意图转头转头腔沉降样品驱动马达真空冷冻生物化学生物化学第一章蛋白质沉降系数(sedimentationcoefficient,S)一种蛋白质在单位离心力场里的沉降速度。常用S（Svedbergunit)表示。生物化学生物化学第一章蛋白质

s=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=离心机转子角速度（弧度/s）

x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）生物化学生物化学第一章蛋白质已测得许多蛋白质的S值都在1×10-13~200×10-13之间，因此，采用1×10-13S作为沉降系数的一个单位。例如：某蛋白质的沉降系数为30×10-13S，可用30S表示。生物化学生物化学第一章蛋白质由沉降系数S可根据斯维得贝格〔Svedberg〕方程计算蛋白质分子的相对分子质量：

M=RST/D〔1－iρ〕R：气体常数T：绝对温度

D：扩散系数i:蛋白质的偏微比容

ρ：溶剂的密度生物化学生物化学第一章蛋白质2、凝胶过滤（又称分子筛层析）是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。原理是：使用葡聚糖凝胶（商品名Sephadex)和琼脂糖凝胶（商品名Sepharose）。该凝胶具有网状结构，网孔大小用交联剂与葡聚糖或琼脂糖的比例来实现。这些网孔只允许较小的分子进入珠内，而大于网孔的分子则被排阻。当用洗脱液洗脱时被排阻的大分子先洗脱下来，小分子后洗下来。生物化学生物化学第一章蛋白质交联葡聚糖（Sephadex）生物化学生物化学第一章蛋白质凝胶过滤法生物化学生物化学第一章蛋白质①当kd=0时，Ve=Vo，溶质全从Vo出来，无分配。②当kd=1时，Ve=Vo+Vi，溶质全进筛子，各物质尽管有分配，但各物质不能分开。③当0〈kd〈1时，Ve=Vo+kd·Vi,各溶质具不同分配，得以分离。生物化学生物化学第一章蛋白质生物化学生物化学第一章蛋白质3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳相对迁移率：蛋白质分子的移动距离与前沿物质移动距离的比值。生物化学生物化学第一章蛋白质相对迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈直线关系。生物化学生物化学第一章蛋白质生物化学生物化学第一章蛋白质生物化学生物化学第一章蛋白质蛋白质的沉淀

如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。沉淀方法类别:

1、高浓度中性盐（盐析、盐溶）

2、酸硷（等电点沉淀）

3、有机溶剂沉淀

4、重金属盐类沉淀

5、生物碱试剂和某些酸类沉淀

6、加热变性沉淀生物化学生物化学第一章蛋白质盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（saltingout）。生物化学生物化学第一章蛋白质2.盐溶和盐析

盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层，使蛋白质溶解度增加；盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层，使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。

分段盐析：不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同，蛋白质溶液中，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。生物化学生物化学第一章蛋白质3.有机溶剂沉淀法

a有机溶剂（与水相溶）争取蛋白质颗粒上的水膜，使之沉淀。

b有机溶剂：乙醇、丙酮

c低温操作，边加入边搅拌，防止局部过热，引起变性，尽量缩短处理时间。生物化学生物化学第一章蛋白质

蛋白质变性与复性

●蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性作用（denaturation）。

生物化学生物化学第一章蛋白质表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和化学性质（化学反应，被酶解性）改变应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；抗衰老……

生物化学生物化学第一章蛋白质蛋白质复性●蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。生物化学生物化学第一章蛋白质蛋白质的紫外吸收光谱

蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm-0.76A1cm280260测定范围：0.1～0.5mg/ml生物化学生物化学第一章蛋白质蛋白质主要呈色反应

双缩脲反应酚试剂反应→蛋白质定量、定性

茚三酮反应测定常用方法

生物化学生物化学第一章蛋白质双缩脲反应

蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物红紫色络合物(硷性溶液)Cu2+生物化学生物化学第一章蛋白质第七节蛋白质的分类根据分子形状分类球状蛋白质纤维状蛋白质结合蛋白质根据组成分类简单蛋白质活性蛋白质（如酶蛋白、转运蛋白、运动蛋白、保护和防御蛋白、受体蛋白…...）根据功能分类非活性蛋白质（如硬蛋白、角蛋白）生物化学生物化学第一章蛋白质简单蛋白质分类生物化学生物化学第一章蛋白质结