DB51T 1474-2012 动物狂犬病防制技术规范　　

2011-11-15发布2012-12-01实施I IV 1 13术语和定义 14诊断 15疫情报告 36疫情处理 3 4附录A(规范性附录)免疫荧光试验 5附录B(规范性附录)小鼠和细胞培养物感染试验 7附录C(规范性附录)内基氏小体检查 9附录D(规范性附录)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测狂犬病病毒抗原 附录E(规范性附录)反转录-聚合酶链式反应检测(RT-PCR) 附录F(规范性附录)塞勒(Seller)氏染色液 附录G(规范性附录)曼(Mann)氏染色液 附录H(规范性附录)人身防护 本标准附录为规范性附录。本标准由四川省畜牧食品局提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准由四川省动物疫病预防控制中心负责起草。本标准主要起草人：余勇、张东、毛光琼、陈斌、侯巍、阳爱国、郭莉、陈冬、文豪。1动物狂犬病防制技术规范本标准规定了动物狂犬病的诊断、监测、疫情报告、疫情处理、预防与控制。本标准适用于四川省省内一切从事饲养、经营动物和生产、经营动物产品，以及从事动物防疫活动的单位和个人。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18635-2002动物防疫基本术语GB/T18639-2002狂犬病诊断技术《中华人民共和国动物防疫法》《中华人民共和国传染病防治法》《重大动物疫情应急条例》3术语和定义下列术语和定义仅适用于本标准。狂犬病(Rabies)狂犬病是由狂犬病病毒引起的急性自然疫源性传染病，所有温血动物均可感染，由于其症状明显，病死率极高，一旦发病，人畜的病死率几乎为100%。我国将其列为二类动物疫病。4.1流行特点虽然几乎所有的温血动物都对本病易感，但在自然界中主要的易感动物是犬科动物和猫科动物，以及翼手类(蝙蝠)和某些啮齿类动物。发病动物和带毒动物是狂犬病的主要传染源，这些动物的唾液中含有大量病毒。本病主要通过患病动物咬伤、抓伤而感染，动物亦可通过皮肤或粘膜损伤处接触发病或带毒动物的唾液而感染。本病的潜伏期长短差别很大，短者1周，长者可达1年以上，一般为2周～8周。咬伤头面部及伤口严重者潜伏期较短；咬伤下肢及伤口较轻者潜伏期较长。4.2临床特征2本病的临床特征为狂躁不安、意识紊乱，死亡率可达100%。狂犬病一般分为两种类型，即狂暴型和麻痹型。4.2.1.1狂暴型可分为前驱期、兴奋期和麻痹期。前驱期：此期约为1天~2天。病犬精神沉郁，常躲在暗处，不愿和人接近，不听呼唤，强迫牵引则咬畜主；性情、食欲反常，喜吃异物。喉头轻度麻痹，吞咽时颈部伸展。瞳孔散大，反射机能亢进，轻度刺激即易兴奋，有时望空捕咬。性欲亢进，唾液分泌逐渐增多，后躯软弱。兴奋期：此期约2天~4天。病犬高度兴奋，表现狂暴并常攻击人畜。狂暴发作常与沉郁交替出现。病犬疲惫卧地不动，但不久又立起，表现一种特殊的斜视惶恐表情。当再次受到外界刺激时，又出现一次新的发作，狂乱攻击，自咬四肢、尾及阴部等。病犬在野外游荡，多半不归，到处咬伤人畜。随病程发展，陷于意识障碍，反射紊乱，狂咬，显著消瘦，吠声嘶哑，夹尾，眼球凹陷，散瞳或缩瞳。麻痹期：此期约1天~2天。麻痹期症状急剧发展，下颌下垂，舌脱出口外，流涎显著,不久后躯及四肢麻痹，卧地不起，最后因呼吸中枢麻痹或衰竭而死。整个病程7天～10天。4.2.1.2麻痹型该型以麻痹期症状为主，兴奋期很短或无。麻痹期始见于头部肌肉，病犬表现吞咽困难，使主人疑为正在吞咽骨头，当试图加以帮助时常遭致咬伤。随后发生四肢麻痹，进而全身麻痹以至死亡，一般病一般表现为狂暴型，症状与犬相似，但病程较短，出现症状后2天~4天即死亡。在发作时攻击其他猫、动物和人。因常接近人，且行动迅速，常从暗处突然跳出，咬伤人的头部，因此猫得病后可能比犬更为危险。4.2.3其他动物牛、羊、猪、马等动物发生狂犬病时，多表现为兴奋、性亢奋、流涎和具有攻击性，最后麻痹衰竭致死。4.3实验室诊断实验室诊断可采用以下方法：4.3.1免疫荧光试验或ELISA(见附录A)4.3.2小鼠和细胞培养物感染试验(见附录B)4.3.3反转录-聚合酶链式反应检测(RT-PCR)(见附录E)4.3.4内基氏小体(包涵体)检查(见附录C)4.4结果判定县级以上动物疫病预防控制机构负责组织动物狂犬病诊断结果的判定。4.4.1被发病动物咬伤或符合4.2特征的动物，判定为疑似患病动物。4.4.2具有4.3.3和4.3.4阳性结果之一的，判定为疑似患病动物。4.4.3具有4.3.1和4.3.2阳性结果之一的，判定为患病动物。4.4.4符合4.4.1且具有4.3.3和4.3.4阳性结果之一的，即判定为患病动物。35疫情报告5.1任何单位和个人发现有本病临床症状或检测呈阳性结果的动物，应当立即向当地县级以上动物疫病预防控制机构、动物卫生监督所或畜牧兽医主管部门报告。5.2当地县级以上动物疫病预防控制机构、动物卫生监督机构或畜牧兽医主管部门接到疫情报告并确认后，按《重大动物疫情应急条例》的规定上报。6疫情处理6.1疑似患病动物的处理6.1.1发现有兴奋、狂暴、流涎等具有典型性狂犬病症状的犬只，应立即采取措施予以捕杀，并将尸体焚化或深埋。6.1.2发现有被患狂犬病动物咬伤的动物后，畜主应立即将其隔离观察10天，限制其移动；对捕杀或在观察期间死亡的动物，应及时采集脑组织送实验室检测。6.1.3对经县级以上动物疫病预防控制机构诊断确认的疑似患病动物，当地人民政府应立即组织相关人员对患病动物进行捕杀和无害化处理，县级动物卫生监督机构应做好监督和技术指导，并由县级动物疫病预防控制机构按规定采样、检测，进行确诊。6.2确诊后疫情处理确诊后，县级以上人民政府畜牧兽医行政管理部门应当按照以下规定划定疫点、疫区和受威胁区，并向当地卫生行政管理部门通报。当地人民政府应组织有关部门采取相应疫情处置措施。6.2.1疫点、疫区、防护带的划分圈养动物，疫点为患病动物所在的养殖场(户);散养动物，疫点为患病动物所在自然村(居民小区);在流通环节，疫点为患病动物所在的有关经营、暂时饲养或存放场所。疫点边缘向外延伸3公里所在区域。疫区划分时注意考虑当地的饲养环境和天然屏障(如河流、山6.2.1.3受威胁区疫区边缘向外延伸5公里所在区域。6.2.2采取的措施6.2.2.1疫点处理措施疫点禁止养犬。6.2.2.2疫区处理措施疫区犬只不准携带、运输出本疫区；停止所有犬、猫交易。46.2.2.3受威胁区处理措施对未免疫犬、猫进行免疫，构建免疫带；停止所有犬、猫交易。6.2.2.4流行病学调查及监测发生疫情后，动物防疫监督机构应及时组织流行病学调查和疫源追踪；每天对疫点内的易感动物进行临床观察；对疫点内患病动物接触的易感动物进行一次抽样检测。6.2.3疫点、疫区和受威胁区的撤销所有患病动物被捕杀并做无害化处理后，对疫点内所有易感动物连续检测、观察30天以上，没有新发病例；疫情监测为阴性；按规定对疫点、疫区进行了终末消毒。符合以上条件，由县级以上兽医部门检查合格后，由原划定机关撤销疫点、疫区和受威胁区。动物防疫监督机构要继续对该地区进行定期疫情监测。7预防与控制7.1免疫接种7.1.1城市犬免疫密度应达到95%以上，农村犬免密度应达到85%以上。对幼犬按照疫苗使用说明书要求及时进行程序化免疫，以后所有的犬每年加强免疫一次。7.1.2所有的免疫犬和其他免疫动物要按规定佩带免疫标识，当地村级动物防疫机构要建立免疫档案。7.2疫情监测每年对老疫区和其他重点区域的犬进行1次~2次监测。采集犬的新鲜唾液，用RT-PCR方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)(见附录D)进行检测。检测结果为阳性时，再将脑组织送省动物预防控制中心实验室进行复核确诊(见4.3)。在运输、出售或出境时，犬、猫的畜主应向有管辖权的县级动物卫生监督机构申报检疫，动物卫生监督机构对检疫合格的犬、猫出具动物检疫合格证明；在运输、出售犬、猫时，犬、猫应具有狂犬病的免疫标识，畜主必须持有检疫合格证明。犬、猫应从非疫区引进。引进后，应至少隔离观察30天，隔离期间发现异常时，要及时向当地乡镇畜牧兽医站或县级动物卫生监督机构报告。养犬场要建立定期免疫、消毒、隔离等防疫制度；养犬、养猫户要注意做好圈舍的清洁卫生、并定期进行消毒，按规定及时进行狂犬病免疫。5(规范性附录)免疫荧光试验A.1材料准备A.1.1器材与试剂：器材：荧光显微镜，恒温箱，载玻片(片厚2mm以下),盖玻片，冰冻切片机。试剂：异硫氰酸荧光黄(FITC)标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白(以下简称狂犬病荧光抗体)和未标记抗狂犬病病毒丙种球蛋白(以下简称狂犬病未标记抗体)。使用时，用0.02%伊文思蓝(Evansblue)染色液稀释成2～4个染色单位。例如，荧光抗体染色效价为1:64,则作1:32～1:8稀释后使用。丙酮(分析纯)使用前置普通冰箱内预冷至4℃左右。0.01mol/LPH7.4磷酸盐缓冲盐水(PBS)。0.02%伊文思蓝染色液。A.1.2样品的采取和运送A.1.2.1对可疑为狂犬病而捕杀或死亡的动物含(实验感染小鼠)应在死亡后3h内(越早越好)由大脑海马回(Ammom氏角),小脑皮质和延髓各切去1cm3组织数块，放入灭菌玻璃瓶，再置于冰瓶内于24h内送达实验室。A.1.2.2不能立即送检者，应加10%福尔马林溶液固定，或加50%甘油生理盐水4℃保存送检。A.1.2.3不能就地取脑时，小动物可送检完整的新鲜尸体，大动物可送检为剖开的头颅。A.1.3标本片的制备A.1.3.1病料标本片制备A.1.3.1.1对新鲜脑组织，可用外科刀切开，已通过火焰去脂的载玻片在其切面上触压一下制成压印片。每张载玻片可接触2～3个部位，每份材料做3～4张。A.1.3.1.2在甘油盐水中保存的新鲜病料，应先用生理盐水彻底洗去甘油，方可制片，制片方法同A.A.1.3.1.3标本片于空气中自然干燥，在冷丙酮中固定4h或过夜，然后在冷磷酸盐缓冲盐水中轻轻漂洗，取出后干燥，在标本区周围用记号笔划圈，立即染色检查，或密封于塑料袋中，置-20℃暂时保存。A.1.3.2细胞培养物标本片制备接种了被检病料的细胞培养物(如神经母细胞瘤细胞),继续在二氧化碳恒温箱中培养48h,随后用橡皮刮子刮取细胞泥在载玻片上制成薄而均匀的涂片。当以盖玻片为载体生长的细胞培养物时，则可直接取此长满细胞单层的盖玻片作为标本片。然后按1.3.1.3风干、固定和保存。A.1.4.1用吸管吸取稀释的狂犬病荧光抗体，滴加1～2滴于经丙酮固定的标本片上，使其布满整个标6A.1.4.2将标本片置于搪瓷盘内(盘底垫以浸湿的纱布，纱布上放玻片架),放37℃恒温箱内着染30mA.1.4.3取出玻片，用磷酸盐缓冲盐水轻轻冲去玻片上多余的染色液，再将玻片连续通过3缸(或杯)磷酸盐缓冲盐水，每缸浸泡3min,并不时轻轻震荡。最后在蒸馏水中浸泡3min。A.1.4.4在吸水纸上轻轻吸取玻片上的蒸馏水，自然干燥后，于标本区上滴加1滴甘油缓冲液(分析纯中性甘油9份，pH7.4磷酸盐缓冲盐水11份),覆盖玻片扣于载玻片上，然后镜检。A.1.5对照设置A.1.5.1已知狂犬病病毒标本片加狂犬病荧光抗体染色应有特异荧光出现。A.1.5.2已知狂犬病病毒标本加狂犬病未标记抗体阻抑后，再加上狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。A.1.5.3已知狂犬病病毒阴性标本片加狂犬病荧光抗体染色，应无特异荧光出现。A.1.6荧光显微镜检查及判定一般用蓝紫光，激发滤光片用BG12,吸收滤光片用OG1或GG9,以满足异硫氰酸荧光黄的荧光谱要求为准。暗视野聚光器比明视野聚光器易于观察特异性荧光。物镜浸油须用无荧光油镜，也可以封片用的甘油缓冲液代替。先检查对照标本。只有在对照标本的染色结果符合1.5.1~1.5.3要求时再去检查被检标本。特异性荧光呈亮绿至黄绿色，背景细胞染成淡黄或橙红色，细胞核成暗红色。狂犬病特异性荧光颗粒大，数量不等，位于细胞浆内。凡在细胞浆内发现特异性荧光，均应判为狂犬病病毒感染者。7(规范性附录)小鼠和细胞培养物感染试验B.1材料准备B.1.1器材：细胞培养瓶(或管),二氧化碳恒温箱，微量超滤器(滤膜孔径0.45μm),微量组织研磨器，普通离心机及离心管，0.25mL注射器及针头等。B.1.2试剂：0.5%水解乳蛋白汉克氏(Hanks)液，伊格尔氏(Eagle)最低要素培养液(EMEM),犊牛血清，20000IU/mL青霉素溶液，20000μg/mL链霉素溶液等。B.1.3小鼠：无特定病原体(SPF)易感小鼠，5~7日龄(也可用3~4周龄者，但发病时间可能稍推迟)。B.1.4仓鼠肾传代细胞(BHK21)或小鼠神经母细胞(NAC1300)细胞。B.2样品的采取和运送除可按照免疫荧光试验1.2的方法和要求送检新鲜脑组织外，还应采集唾液送检。方法是：用灭菌吸管吸取或用灭菌棉拭棒蘸取腮腺口附近的唾液，置于1mL～2mL内含2%灭活豚鼠血清和抗生素的Hanks液中，低温保存备用。B.3样品的处理脑组织用研磨器磨碎，加0.5%水解乳蛋白Hanks液制成20%(m/V)混悬液，以3000r/min离心30min,吸取上清液，加入青霉素500IU/mL和链霉素500μg/mL,在4℃处理3h~4h,即可用于感染小鼠和细胞培养物的接种样品。唾液样品亦需经上述离心和杀菌处理。怀疑有污染的样品，可用0.45μm微孔滤膜过滤法处理。B.4感染方法B.4.1小鼠感染法每份样品用小鼠4～6只。左手固定小鼠，在耳与眼之间用碘酒消毒。右手持吸取接种样品的0.25mL注射器在消毒部位刺入硬脑膜下，每只小鼠注射0.03mL。对照小鼠2只，按同发同剂量注射稀释液(即0.3%水解乳蛋白Hanks液)。每天早晚各观察1次，记录是否有发病小鼠。至少观察28d。B.4.1.1细胞培养物感染法每份样品接种4～6管细胞培养物。取接近长成单层的细胞培养物用Hanks液清洗1次，每管接种样品0.1mL～0.2mL,在37℃恒温箱内吸附1h,用Hanks液洗1次(亦可不洗)加入含有1%～2%犊牛血清的EMEM液(添加量随细胞瓶大小而定),放二氧化碳恒温箱(37℃)内继续培养。同时设细胞对照2管，以0.5%水解乳蛋白Hanks液替代样品上清液。每天观察1次，记录是否有致细胞病变作用(CPE)出现。观察15d。B.5感染性鉴定8B.5.1小鼠感染性签定若对照小鼠健活，而样品接种小鼠在接种后4d~7d开始发病，呈现痉挛、麻痹等神经症状并死亡，可确诊为狂犬病感染者。如果症状不典型，可捕杀取脑，采用内基氏小体检查或免疫荧光试验鉴定之。如果7d后不发病，可将其中2只小鼠放血致死，取脑作成10%(m/V)混悬液，接种健鼠盲目传代；第2代在7d左右还不发病时，在盲传1代；至第3代经4周观察仍不发病时，可报告狂犬病小鼠感染试验阴性。对观察期间死亡的小鼠，应进行内基氏小体检查或免疫荧光检查以鉴别之。B.5.2细胞培养物感染性鉴定若对照细胞培养物正常，而样品接种的细胞不论是否出现细胞病变，但经免疫荧光试验证实有特异性荧光时，可确诊为狂犬病感染者。为缩短检验时间，可在接种后48h抽取1～2管细胞培养物进行免疫荧光试验。对既无细胞病变又无特异性荧光反应者，可在盲传2次。第3代经15d观察仍无细胞病变和特异性荧光时，可报告狂犬病细胞培养物感染试验阴性。9(规范性附录)内基氏小体检查C.1.1器材：胶皮手套、口罩、防护眼镜等个人防护器具、骨锯、骨凿、骨剪、脑刀等动物解剖器具；切片机、染缸等组织制片与染色器具；光学显微镜C.1.2标本保存液10%(体积分数):福尔马林溶液50%(体积分数),甘油生理盐水。C.1.3染色液：塞勒(Seller)氏染色液，曼(Mann)氏染色液，其配制方法见附录F、G。C.1.4人身防护：见附录H。C.2样品的采集和运送见附录A1.2C.3标本片制备C.3.1对新鲜脑组织，可用外科刀切开，已通过火焰去脂的载玻片在其切面上触压一下制C.3.2成压印片。每张载玻片可接触2～3个部位，每份材料做3～4张。C.3.3在甘油盐水中保存的新鲜病料，应先用生理盐水彻底洗去甘油，方可制片，制片同C.3.1。C.3.4所有压印片于室温下干燥后，浸入甲醇溶液固定2min。C.3.5经10%福尔马林溶液充分固定过的脑组织可按常规方法制备组织学切片。C.4.1塞勒氏染色法在经过甲醇固定并风干的压印片上，滴加塞勒氏染色液(以盖满压印面而不溢为度)着染5s~10s,然后用蒸馏水冲洗，干燥后镜检。C.4.2曼氏染色法C.4.2.1将经过甲醇固定并风干的压印片，或者经过脱蜡、浸水、风干的切片浸入曼氏染色液中浸染。压印片浸染5min,切片浸染时间因温度而异(室温下24h,或38℃温箱中12h,或60℃温箱中2h。)C.4.2.2以蒸馏水快速吸取染色液，至无浮色出现为止，用吸水纸吸干。C.4.2.3以无水乙醇稍洗，至标本区刚出现蓝色为度。C.4.2.4浸入碱性乙醇分化15s~20s,至标本区出现红色。C.4.2.5依次通过无水乙醇和蒸馏水各数秒钟，分别洗去氢氧化钠和乙醇，在浸入微酸性水中1min~2min。酸化期间，经常于显微镜下观察，至细胞核出现蓝色为宜；如果核蓝色过深，说明酸化过度，可退回至碱性乙醇，再作短时分化。C.4.2.66以蒸馏水水洗后，依次通过95%乙醇和无水乙醇脱水，并经二甲苯透明，最后加香胶封固。C.5显微镜检查及判定内基氏小体嗜酸性，位于神经细胞胞浆中，呈圆形、椭圆形或棱形，直径3μm~20μm,一个细胞内通常含有一个内基氏小体，但也可含有几个。用塞勒氏染色时，内基氏小体呈桃红色，神经细胞为蓝紫色，组织细胞为深蓝色。用曼氏染色时，内基氏小体为鲜红色，神经细胞的胞核为蓝色，胞浆为淡蓝色，红细胞为粉红色。有时，在鲜红色的内基氏小体中还可以见到嗜碱性的蓝色小颗粒。内基氏小体即狂犬病包涵体，为狂犬病所特有。因此一旦检出内基氏小体，即可确诊。但在检查犬脑时，应注意与犬瘟热病毒引起的包涵体相区别。犬瘟热包涵体主要出现于呼吸道、膀胱、胆囊、胆管等器官粘膜上皮细胞的胞浆细胞核内。在脑组织内，见于原浆细胞核一些小胶质细胞的核内，在神经原内很少见到。(规范性附录)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测狂犬病病毒抗原D.1试验材料D.1.1用于检测的标本为狂犬病患者脑脊液或死亡后脑组织D.1.2抗狂犬病病毒特异性单克隆抗体混合包被的酶标板条。D.1.3阳性病毒对照(冻干，已灭活)。D.1.4样品稀释液：PH7.4D.1.5辣根过氧化物酶标记的狂犬病病毒单克隆抗体。D.1.6洗涤液：PH7.4PBS-T(PBS+0.05%吐温-20)。D.1.8终止液：4NH2SO4。D.1.9酶标仪D.2检测步骤D.2.1取待检脑组织加样品稀释液研磨制成10%脑组织悬液，或直接取待检脑脊液约0.5mL,用稀释液将待检脑悬液和阴性、阳性对照各1:20稀释(阴性对照自设，待检脑脊液不稀释),加入各自对应孔中，其中待检测样品各一孔，阴性、阳性对照各2孔，100μL/孔。设2孔为空白对照，只加样品稀释液，100μL/孔，将酶标可拆板置湿盒内，37℃温育30min。剩余的阳性病毒对照保存于-20℃备用。D.2.2将浓缩的洗涤液用蒸馏水30倍稀释成工作浓度，取出酶标板，甩干，将洗涤液加满各孔，倾出，甩干，重复以上操作共3次。D.2.3取酶结合物加入各孔(空白对照孔中不加酶结合物),100μL/孔或2滴，置湿盒内，37℃温育3D.2.4取出酶标板、倾出液体，甩干，同上法洗板6次。D.2.5将显色液A/B各一滴加入各孔中，置湿盒内至阳性对照显蓝色。将终止液加入各孔，50μL/孔或一滴，终止反应。置酶标仪上读数。D.3结果判定空白和阴性对照孔无色，而阳性对照孔显蓝色，则结果成立。以空白两孔的平均数调零，在酶标仪上测定450nm处各孔吸光(A)值大于或等于阴性对照A平均值+0.08,即30D阴性对照+0.08,则表明该样品为狂犬病抗原阳性。(规范性附录)反转录-聚合酶链式反应检测(RT-PCR)E.1试验材料E.1.1可用于狂犬病患者诊断的标本：唾液、泪液、尿液、鼻咽洗液、后颈带毛皮囊的皮肤组织或脑脊液等；死亡后用于诊断的标本：脑组织。E.1.2PCR扩增引物：以特异性扩增狂犬病病毒核蛋白(NP)基因最保守区域为目的基因片段，设计一对引