食品微生物检验及2010国标(精)

食品卫生微生物学检验及国标GB4789-2010

总则、菌落总数、霉菌酵母菌计数、商业无菌

大肠菌群计数

沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌检验方法

其他致病菌内容提要食品卫生标准中的微生物指标指示菌概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检样卫生状况及安全性的指示性微生物类型：一般性、特定性（如粪便污染）、其他项目：菌落总数、大肠菌群、耐热大肠菌群、总大肠菌群食源性致病菌及其毒素沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希氏菌等霉菌酵母菌及其毒素黄曲霉毒素B1、B2等其他项目抗生素残留、beta-内酰胺酶、商业无菌等菌落总数的意义反映食品被细菌污染的程度预测食品耐放程度和时间估测食品腐败状况实际上是把检样中得致病菌、非致病菌、酵母菌、霉菌都计算在内的微生物杂菌总数由于倾注平板法的局限，会有一部分细菌在该实验条件下不生长，故计数结果要比实际值低GB/T4789.2-2010菌落总数操作流程图提示：若样品中可能含有表面蔓延生长的菌落时，可在培基凝固后再覆盖一薄层培基水产品置于30℃±1℃培养72h±3h。菌落总数的几个概念菌落总数：AerobicPlateCount，食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培基、温度、时间、pH、需氧性质等）所得1mL（g）检样中形成菌落的总数。只包括一群在平板技术琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。菌落总数不等于细菌总数。菌落：Colony，单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有一定形态细菌群落。CFU:ColonyFormingUnits，菌落形成单位菌落计数方法有较大片状菌落生长者不宜采用，若片状小于平板一半时且余部均匀分布，则以半个平板菌落数2倍报告无明显界限链状菌落每条单链视为一个菌落选取菌落数在30~300cfu之间，无蔓延生长的平板计数低于30的记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计，每个稀释度采用两个平行的均数计数结果的表述若只有一个稀释度平板在30~300CFU，则计算两平行平板的均数，再乘以稀释倍数报告之若有连续两个稀释度符合计数要求则按下公式例1：10-2=232，24410-3=33，35例2：10-1=232，24410-2=33，29

菌落总数所有符合计数要求的平板菌落数之和较低稀释度有效平板数较高稀释度有效平板数较低稀释度的稀释倍数N=(232+244+33+35)(2+2×0.1）×10-1新计数公式的统计学依据平板菌落数越多，结果越具有代表性（不考虑稀释倍数和培养基的营养状况等）取样量越大，结果越具有代表性（同等取样条件、排除其他方面的干扰因素）不同的取样量赋予不同的权重，而不是简单的取平均值。新旧方法计算同一结果会有所不同结果表述10-1均数10-2均数描述最终结果25536均在30~300间则按计数公式2.6×103多不可计345各平板均>300，取稀释度最高者报告，余计为多不可数3.5×104122均小于30则取稀释度最低者报告1.2×10233029所有平板均不在30~300CFU且一部分<30或>300者以最接近30或300者报告2.9×10300所有平板均无菌落则记为1乘以最低稀释倍数报告1×10，10报告方式菌落数在100cfu内时按四舍五入修约，采用两位有效数字报告大于或等于100时，第三位数四舍五入修约，取前两位数字，例：20504321000or2.1×105所有平板均为蔓延菌落而无法计数者报告菌落蔓延若空白对照有菌落则此次检测结果无效固体样品以cfu/g，液体以cfu/mL为单位GB/T4789.15-2010霉菌酵母菌计数基本过程类似菌落总数所用培养基为孟加拉红、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（PDA）稀释液为无菌蒸馏水培养温度为25~28度，时间为5天计数方法：选择10~150cfu的平板报告之，余规则同菌落总数霉菌和酵母菌的食品卫生学意义霉菌酵母菌可使食品和粮食发生霉变，常在低pH、低湿度、高盐、高糖含量食品中出现低温贮存的或含抗生素的食品亦可出现霉菌酵母菌能合成有毒代谢物引起各种急慢性中毒，特别某些霉菌毒素强烈致癌作为评价食品卫生质量的指示菌，判定食品被其污染程度，便于对检样进行卫生学评价典型霉菌酵母菌菌落形态观赏酵母菌菌落多类似细菌菌落，但大而厚，湿润、粘稠、易挑起，某些菌种长时间培养而呈皱缩状。颜色多为乳白、少数红色。霉菌菌丝粗长，其菌落疏松，呈绒毛状、棉絮状或蛛网状。有的菌落呈圆形，有的无定形。由于其形成的孢子不同故其菌落常呈现肉眼可见的不同结构和色泽特征。商业无菌概念：罐头食品经过适度的杀菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物。这种状态叫做商业无菌。保温：低酸性罐头食品——36±℃，10天酸性罐头食品——30±1℃，10天预定输往热带地区的低酸性食品——55±1℃，5~7天每日检查是否胖听、泄露

开罐

留样pH测定感官检查涂片染色接种GB4789.3-2010大肠菌群测定定义：Coliforms，一群在36℃培养48h可发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源自人畜粪便，作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能。大肠菌群的食品卫生学意义作为粪便污染食品的指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低作为肠道致病菌污染食品的指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量产气克雷白氏菌ETEC

EIEC

阴沟肠杆菌EHEC

大肠菌群耐热大肠菌群（粪大肠菌群）大肠杆菌产气克雷白氏菌大肠埃希氏菌柠檬酸杆菌O157：H7大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。一般生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引起感染。大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。一般认为可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。

总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。耐热大肠菌群即粪大肠菌群，作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。致病性大肠杆菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，具有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠毒素性大肠杆菌（ETEC）和肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）等。O157:H7（EHEC)肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系第一法MPN法初发酵：月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤（LST）替代了乳糖胆盐发酵培基确证实验：煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）替代了乳糖复发酵培养基，取消了革兰氏染色实验培养时间：由24h延长至48h单位：由MPN/100g变为MPN/g取样量：由3.33g0.333g大肠菌群计数检验流程0将产气的试管内样品接种到BGLB肉汤LST不产气（-）

小导管里无气泡

LST产气（+）如何报告结果？根据经确证后的对应浓度阳性管数查MPN表MPN：最可能数，基于泊松分布的一种间接计数方法阳性管数MPN95%可信限0.100.010.001下限上限000<3.0-9.50013.00.159.61003.60.1718333>1100420-理想与现实的差距新的方法更加严谨、合理、科学，与世界接轨然而老的卫生标准仍然沿用MPN/100g（mL）0.3MPN/g=30MPN/100g？如何换算？30MPN/100g0.3MPN/g加样量相应扩大10倍1g，0.1g，0.01g符合原方法的取样量

查表，结果相应缩小10倍统计学上并不一定成立，只是过度临时采用

仍然报告为0.3MPN/g，但要通知相关人员原因第二法VRBA平板计数法选择15~150平板计数典型和可疑菌落36℃±1℃18h~24h挑选10个菌落接种到BGLB典型菌落为紫红色周围有红色胆盐沉淀环，0.5mm致病菌的食品卫生学意义食品卫生标准规定任何食品中不得检出致病菌致病菌对人体健康的威胁是直接的和肯定的根据不同食品被污染的特点重点检验某些细菌如蛋禽肉主检沙门氏菌，罐头检肉毒梭菌等微生物毒素也是重点，如金葡的肠毒素、黄曲霉毒素等微生物与食物中毒概念：指摄入了含有生物性、化学性有害物质的食品或把有毒有害物质当作食品摄入后出现得非传染性的急性、亚急性疾病。特点：潜伏期短，来势急剧，短时多人同时发病；临床表现大致相同；与吃某种有毒食品有关；发病率高，人与人之间并不传染。分类：微生物性（细菌性、真菌性），化学性，动、植物性，以细菌性最常见。细菌性食物中毒概念：由于食入被病原菌或其毒素污染的食物后所引起的以急性肠胃炎为主的疾病。分类：感染型、毒素型、不定型病原菌常见食品潜伏期病程症状沙门氏菌肉乳蛋6~8h3~7d恶心呕吐腹痛发热冷汗头痛副溶血性弧菌水产品腌制品8~24h1~3d恶心呕吐腹痛腹泻蜡样芽孢杆菌米饭肉乳淀粉类30~60min1d恶心呕吐腹痛腹泻志贺氏菌简介志贺氏菌属为埃希氏杆菌，包括痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌四群，是引起人类细菌性痢疾的病原菌。它们主要通过食品加工、集体食堂和饮食行业的从业人员中痢疾患者或带菌者污染食物，从而导致痢疾的发生，是一种较常见的、危害较大的致病菌。志贺氏菌的鉴定主要根据血清学反应，再以生化反应证实。志贺氏菌检验流程志贺氏菌属生化特性试验挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和半固体琼脂各一管。志贺氏菌在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸而不产气(福氏志贺氏菌6型可微产气)，斜面产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内沿穿剌线生长。然后再做V-P/苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵试验，结果均应阴性反应。葡萄糖半固体

（无动力）GB/T4789.10/38－2010金黄色葡萄球菌检验致病性：金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，因而食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。检测流程计数及血浆凝固酶实验接种BHI肉汤及营养琼脂斜面溶血性链球菌形态与染色：球形或椭圆形链状排列，无芽胞无鞭毛，革兰阳性培养特征：营养要求较高，普通培基生长不良。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐、细小菌落。致病性：分布较广存在，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。常通过以下途径污染食品：食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；熟食制品因包装不善而使食品受到污染。可引起皮肤、皮下组织的化脓性炎症、呼吸道感染、流行性咽炎的爆发性流行以及新生儿败血症、细菌性心内膜炎、猩红热和风湿热、肾小球肾炎等变态反应。蜡样芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌是一种地方性，土壤生活的，革兰氏阳性β溶血性的杆状细菌，它会引起食物中毒，例如“炒饭综合症”，会产生防御性的内芽孢。由于错误地烹调方法造成孢子残留在食物上，更严重的是不当冷冻而让孢子发芽。细菌繁殖产生肠毒素，人食用后会产生呕吐、腹泻等不良症状。潜伏期8–16h。吃了冷藏不当而变质的剩饭是造成呕吐病症的最主要的原因。食用变质食物后1–5小时就会引起恶心、呕吐。这种病症与其他的变质引起的短期病症（如金黄色葡萄球菌所造成的）较难辨别。副溶血性弧菌检验弧菌科细菌的特点：1.革兰氏阴性杆菌或弯曲状的杆菌。2.端鞭毛，能运动。3.不形成内生孢子或小孢囊。4.有机化营养与兼性厌氧菌。5.无脱氮作用。6.大部分菌株为氧化酶阳性。7.可利用D-葡萄糖作为碳源和能源.8.大部分菌株可利用氨盐作为氮源。9.大多数需要2-3%氯化钠或海水为生长条件。10.水内寄生菌，可在淡水、海水或水生动物中发现。11.某些种别对人、鱼、鳗和青蛙等有致病性。12.DNA中G+C含量为38~63mol%副溶血性弧菌生长特性在TCBS平板上分解蔗糖产酸的菌落为黄色。副溶血性弧菌等不分解蔗糖为蓝绿色菌落。TSI-NaCl副溶血弧菌分解葡萄糖产酸，所以底部为黄色，不产硫化氢，而分解蛋白胨产生的碱使斜面变红。阪崎肠杆菌阪崎肠杆菌属于肠杆菌科、肠杆菌属，是在人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，是肠道正常菌丛的一种，具有机会致病性。能引起新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并可引起神经系统后遗症和死亡，死亡率高达50%以上。目前，虽然还不能确定阪崎肠杆菌的宿主和传播途径，但多起新生儿阪崎肠杆菌感染事件表明了婴儿配方奶粉是目前发现的主要感染源。继美国FDA2002年在本土某些国际乳业巨头生产的婴儿配方奶粉中检出该菌后，2003年又一家国际乳业巨头主动召回一批检出极微量阪崎肠杆菌的奶粉，此后成为世界关注的焦点。我国在2005年5月通过《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准的审定，对奶粉严查此菌。

阪崎肠杆菌检验流程10ml+mlST-Vm90ml或10ml+EE肉汤90ml36℃±1℃，24h±2h检样100g（ml）+BPW稀释液900ml36℃±