DB4505T 0010-2023 岛礁石斑鱼生态增殖技术规范

4505TechnicalspecificationforecologicI前言 III 12规范性引用文件 13术语和定义 14海域及容量选择 24.1海域自然条件 24.2增殖容量 25种类选择 26苗种繁育、规格及适应性驯化 26.1苗种繁育 2 26.3适应性驯化 27苗种检验检疫 37.1检验资质机构要求 37.2抽检原则与数量要求 37.3检验内容与方法 38苗种原生性鉴定 38.1用于微卫星标记检测的样品采集 38.2样品采集、运输与保藏条件 3 38.4微卫星基因分型方法 38.5统计分析 48.6原生性判定 49生态增殖 49.1苗种类型 49.2增殖放流方法 49.3苗种比例及放流要求 410增殖效果评估 410.1基于标志石斑鱼的增殖效果评估 4 510.3基于微卫星分子标记的增殖效果评估 5 5附录A(规范性)石斑鱼生态增殖放流情况记录表 6附录B(资料性)环境DNA的调查方法 7 7 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定广西精工海洋科技有限公司、湛江市东海岛东方实业有1岛礁石斑鱼生态增殖技术规范GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：GB/T20361水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法GB31656.13食品安全国家标准水产品中硝基呋喃类代谢物多残留的测定液相色谱-串联质GB/T34748.7水产种质资源基因组DNA的微卫星分析第7部分：NY5070无公害食品水产品中渔药残留限量农业部公告第1125号一、二、三类动物疫病病种目录（水生动生态增殖ecologicalenhanc适应性驯化adaptivedome24海域及容量选择4.1海域自然条件b)溶解氧≥5mg/L,盐度22～35,水温22℃~33℃。4.2增殖容量5种类选择6苗种繁育、规格及适应性驯化6.1苗种繁育定的方法进行，培育期间应做好培育过程的采样分析和观测数据记录，主要包括海水理化因子(水温、溶解氧、pH、盐度、氨氮和有机质等)、投喂的饲料类型(或活饵种类)、饲料粒径(饲料号数)、苗6.3适应性驯化a)苗种放流前14d~28d宜模拟增殖海域的水温、盐度等环境条件对苗种进行驯化；37苗种检验检疫规格合格率≥90%以上，死亡个体比例、伤残率其它到无公害食品类标准8.1.1原生种：在放流物种分布的海域内随机抽样，数量为50尾～60尾。8.1.2待检苗种群体：随机抽样，每批次取样50尾～60尾。10mL离心管中的无水乙醇更换一次，放入-80℃或-20℃低温冰箱长期保存。8.3DNA提取按常规酚-氯仿法提取总DNA,放入-80℃或-20℃低温冰箱长期保存。8.4微卫星基因分型方法4利用微卫星分子标记分析软件GeneMapper和Cervus进行遗传多样性和基因流分析。8.6原生性判定当待检苗种群体与原生种群体间不存在显著遗传差异(P>0.05),可判定待检苗种群体与本地群体存在明显基因交流，属于同一种群来源。9生态增殖9.1苗种类型9.1.1未标志石斑鱼苗种未进行过任何标志处理的石斑鱼苗种。9.1.2标志石斑鱼苗种采用挂牌、金属线码、被动式整合雷达标志、超声波标志或无线电标志等方法进行标志处理的石斑鱼苗种。9.2增殖放流方法9.2.1原位增殖根据岛礁自然礁体结构和生物资源、生态环境现状以及拟增殖石斑鱼种类的栖息习性等基础数据，直接将规模化培育的大规格苗种在石斑鱼原生种的栖息生境进行增殖。9.2.2定点增殖将石斑鱼苗种运送到适宜石斑鱼栖息的预设站位放流，进行增殖。9.3苗种比例及放流要求标志石斑鱼占石斑鱼总放流量的比例宜为5%～10%。标志石斑鱼群体与未标志群体应在同一海域、同一站点和同一时间进行放流。标志与未标志石斑鱼的数量比在每一个放流站点应尽量保持一致。对石斑鱼的增殖放流情况应做好记录(见附录A)。10增殖效果评估10.1基于标志石斑鱼的增殖效果评估10.1.1放流一年后在放流海域进行监测性回捕。从每个增殖放流石斑鱼种类回捕样本中各随机抽取50尾～60尾，分别统计每种石斑鱼抽样样本中标志石斑鱼的个体数，基于标志石斑鱼个体数计算石斑鱼回捕占比率，见公式(1):RMA={∑i=1(Ni/Pi)]/Zi=1T}×100%………………RF—石斑鱼增殖放流群体回捕占比率，用%表示：a—石斑鱼增殖放流种类个数：5Pi——第i种类标志石斑鱼在该种类放流石斑鱼中的占比，用％表示；T优良差RMH≥20%＜5%按照附录B的方法对放流海域的环境DNA进行调查和分析，鉴定放流海域存在的石斑鱼种类和相对表3基于微卫星分子标记的石斑鱼生态优良差RH≥20%＜5%斑鱼的活动和生长情况，为进一步优化石斑鱼生态增殖技术6pH7积物处取1L海水，重复取样3次，1L去离子水作为对照。用于鱼类属、种鉴定的条形码为12SrRNA基因，片段长度为163bp～18MiFish-U-F：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3’MiFish-U-R：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNCATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3’在上述两条引物中，前面的33个和34个核苷酸（nt）部分为高通量测序引物的结合位点，随后的6个随机引物（NNNNNN，如AAGGTT）用于促进测序平台流动池（flowcell）DNA簇的分离，最后的21个和5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’在上述两条引物中，8个连续X碱基代表Illumila测序技术通用的Index序列，可以用于区分不同样连续X碱基后面的3’端序列是Illumila测8延伸15s，共30个循环；72℃再延伸5min。将第一轮PCR产物稀释10倍作为第二轮PCR模板，PCR体系的采用生物信息学软件FastQC、Cutadapt和USEARCH，对原始测序数据质量进行分析并去除低质量数据。采用QIIME2分析软件，在97％的序列相似水平下，对高质量的eDNA测序序列数据进行聚类，去通过序列比对方法，将所有的分类单元数据与已知物种的核糖体RNA序列数据库进行序列比对，从B.5.7.1特定石斑鱼属的相对丰度为特定石斑鱼属序列条数占全部鱼类序列条数的百分比，计算见公=(⁄)×100%······································Rg——特定石斑鱼属相对丰度，用％表示；9B.5.7.2特定石斑鱼种的相对丰度为特定石斑鱼种序列条数占全部鱼类序列条数的百分比，计算见公=(⁄)×100%·····························································(A.2)Rs——特定石斑鱼种相对丰度，用％表示；基于微卫星分子标记的石斑鱼增殖放流群体回捕占对于用于增殖放流的不同种类石斑鱼，增殖放流前分别采集原生种群和增殖放流苗种群体样本各50尾～60尾，回捕时分别从每种石斑鱼的回捕样本中随机抽采用常规的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取石斑鱼样本DNA，DNA浓度≥50ng/μL，分别筛选各增殖放流石斑鱼种类的高度多态性微卫星分子标记用于遗传多样性分析。按照GB/T34748.7规定的方法进行分析，对所有增殖放流种类的石苗种群体和原生种群间的遗传距离，如某一种类石斑鱼回捕抽样样本与该种类增殖放流苗种群体具有相似的分子遗传特征，且聚为一类时，可确定其为该种类增殖放流群体的回捕个统计每种石斑鱼回捕抽样样本中增殖放流群体的回捕个体数，计算石斑鱼增殖放流群体回捕占比）：=∑"∑!#×100%·················································(C.1)Ci——第i种类增殖放流石斑