食品分析第十一章-蛋白质和氨基酸的测定

第十一章蛋白质和氨基酸的测定1、蛋白质的测定原理、测定方法、注意事项。2、氨基酸的测定原理、测定方法、注意事项。1、蛋白质的性质和测定意义；2、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要；3、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。2.重点1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。3.难点3.1.基本知识点食品中蛋白质和氨基酸的测定学习目标§1概述一、蛋白质概况蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S元素组成。有些还含有微量的P、Cu、Fe、I等。含氮是蛋白质的主要标志。在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素）。食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。二.测定意义1.蛋白质是组成人体的重要成分之一，人体的一切细胞都由蛋白质组成。

2.蛋白质维持体内酸碱平衡。

3.蛋白质是食品的重要组织部分之一，也是重要的营养物质。

4.蛋白质是评价食品质量高低的指标，还关系到人体健康。

三、蛋白质测定方法一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。具体测定方法：凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。双缩脲反应、染料结合反应、酚试剂法国外：红外分析仪氨基酸的测定方法：酸碱滴定法——测定氨基酸总量。色谱技术——各种氨基酸的分离与定量。有多种氨基酸分析仪。§2蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并显色。二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（二）脂蛋白的显色§3蛋白质的定量测定

一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。一、凯氏定氮法新鲜食品中的含氮物质大都以蛋白质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以换算系数，即可得到蛋白质含量。由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。一些蛋白质的含氮量

一般为15%~17.6%，有的上下浮动

可以测出总氮N

=N×6.25=蛋白质含量

一般蛋白质含氮量是16%，即1gN约等于6.25g蛋白质（一）常量凯氏定氮法1.原理样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用标准酸滴定，根据标准酸消耗量可计算出样品中蛋白质含量。（1）样品消化2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后炭化为碳、氢、氮；浓硫酸具有氧化性，将碳变为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫；2H2SO4+C2SO2+2H2O+CO2为缩短消化时间常加入以下试剂：硫酸钾

作为增温剂，提高溶液沸点，加速氧化，促进有机物分解；纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。

硫酸钾不宜用太多，否则温度太高，生成的硫酸铵容易分解。硫酸铜

作为催化剂同时作为消化终点指示剂。也可加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。氧化剂

如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。消化（2）蒸馏消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。2NaOH+（NH4）2SO4

2NH3+Na2SO4+H2O以硫酸铜作为指示剂，判断终点；当溶液颜色由蓝色变为黑色氧化铜时，说明蒸馏完全。蒸馏

（3）吸收与滴定加热蒸馏放出的氨，用硼酸溶液吸收，吸收完全后，再用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红-溴甲基酚绿混合指示剂或用亚甲基兰-甲基红）。2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7(NH4)2B4O7+5H2O+2HCL2NH4CL+4H3BO3

混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈红色。

结果计算式中：X—试样中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL；V1—试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；c—盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；M—N的摩尔质量，14.01g/mol；m—样品的质量或体积，g；F—氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高粱为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30。计算结果保留三位有效数字。2.适用范围

此法用于各类食品中蛋白质含量的测定，是国家标准分析方法。3.说明①所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。②消化时不要用强火，应保持缓和沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。③消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。④样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。⑤当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢2—3m1后再继续加热消化。⑥若取样量较大，如干试样超过5g可按每克试样5m1的比例增加硫酸用量。⑦—般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。⑧蒸馏装置不能漏气。⑨蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。

⑩蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。⑾混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，中性溶液中呈灰色，酸性溶液中呈红色。（二）微量凯氏定氮法1.原理同凯氏定氮法。2.样品消化同凯氏定氮法。3.试剂浓度及用量与常量法不同如：加入硼酸量有50ml10ml

滴定用盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L10-210-24.说明蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，防止发生倒吸。蒸汽发生器中的水装至2/3容积，且要保持酸性，防止水中氨被蒸出。（三）自动凯氏定氮法特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完成1个样。凯氏定氮仪

二、双缩脲法1.原理

脲（尿素）NH2—CO—NH2

加热至150~160℃时，两个分子间脱去一个氨分子生成双缩脲。NH2—CO—NH2+NH2—CO—NH2NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3

双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键—CO—NH—

与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量；该配合物的最大吸收波长为560nm。2.方法特点及应用范围

本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。三．紫外吸收法1.原理蛋白质及其降解产物的芳香环残基在紫外区内对一定波长的光有吸收作用。在280nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系。│R（—NH—CH—CO）2．适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。四、福林-酚比色法原理：

蛋白质与福林-酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性铜盐产生双缩脲反应，同时由于蛋白质中存在酪氨酸与色氨酸同磷钼酸-磷钨酸试剂显色。颜色深浅与蛋白质含量呈正比。

福林酚法灵敏度高，实测下限较双缩脲法约小2个数量级。五、考马斯亮蓝染料比色法原理：考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范德华力结合，使蛋白质染色，在620nm处有最大吸收，可定量测定蛋白质。此法简单快速，不受酚类、游离氨基酸和小分子的影响，灵敏度和福林-酚相似。六、染料结合法原理：在特定条件下，蛋白质可与某些染料定量结合而生成沉淀，用分光光度计测定沉淀反应完成后剩余的染料量，可计算出反应消耗的染料量，从而计算出样品中蛋白质含量。适用范围：适用牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力饮料、脱脂乳粉等食品。§4氨基酸的定量测定一．氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法原理：氨基酸本身有碱性—NH2—

基，又有酸性—COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，甲醛与—NH2—

结合，碱性消失，再用强碱来滴定—COOH基。特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）

样液中有其他的酸性物质使测定结果不准确；3．双指示剂：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性红50%乙醇溶液，④0.1mol/L氢氧化钠标准溶液。4．操作：同时取两份样：①+中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。二者之差可计算氨基酸含量

（二）电位滴定法

原理：根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成原电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的PH值判定滴定终点。

（三）茚三酮的比色法

原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。

最大吸收波长为570nm。§5氨基酸的分离与测定

一．薄层色谱法（薄层层析法（TLC法）近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。（一）原理：

取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等