《动物分枝杆菌多重实时荧光 PCR 检测方法》

ICS11.220

B41

团体标准

T/CVMAX—2020

动物分枝杆菌多重实时荧光PCR检测方法

Multiplexreal-timePCRdetectionmethodofMycobacteriuminanimal

征求意见稿

2019-XX-XX发布2019-XX-XX实施

中国兽医协会发布

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动物分枝杆菌多重实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了动物分枝杆菌多重实时荧光PCR检测试剂、仪器设备、实验操作步骤。

本标准适用于动物组织、分泌物、血液、粪便和培养物中分枝杆菌的核酸检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法

GB19489-2008实验室生物安全通用要求

NY/T541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

GB/T18645-2020动物结核病诊断技术

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件

EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）

PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebuffersaline）

ITS：内转录间隔区（InternalTranscribedSpacer）

UNG：尿嘧啶DNA糖基化酶（UracilN-Glycosylase）

DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

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Tm值：在热变性过程中，随着温度的逐渐升高，探针逐渐从靶序列上脱落，其双链解链到一半时所

对应的温度称为他们的熔解温度（MeltingTemperature）

5试剂和耗材

5.1试剂

5.1.1蒸馏水或灭菌双蒸水：常温保存。

5.1.275%乙醇：可购买，或者用无水乙醇和灭菌后双蒸水配制。

5.1.3柠檬酸钠缓冲液：配制方法按附录A中A.1。

5.1.40.5mol/LEDTA：配制方法按附录A中A.2

5.1.50.01mol/LpH7.6PBS：配制方法按附录A中A.3。

5.1.64%氢氧化钠消化液：配制方法按附录A中A.4。

5.1.7血液抗凝剂：商品化试剂。

5.1.8DNA提取液：配制方法按附录A中A.5。

5.1.9多重实时荧光PCR检测（熔解曲线法）试剂：厦门致善生物科技股份有限公司购买。

5.2耗材

5.2.1无菌注射器。

5.2.2真空采血管。

5.2.3无菌离心管。

5.2.4荧光定量PCR管（0.2mL）。

5.2.5微量移液器吸头（与微量移液器相应规格适配）。

6仪器与设备

6.1超净工作台。

6.2荧光定量PCR扩增仪（如SLAN-96S：上海宏石医疗科技有限公司）。

6.3高速台式冷冻离心机，可控温至4℃，离心速度可达15000g以上。

6.4微量移液器：量程为0.5µL~10µL、2µL~20µL、20µL~200µL和200µL~1000µL。

6.5涡旋震荡仪。

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6.6分析天平。

6.7冰箱：2℃~8℃、-20℃和-80℃以下。

6.8恒温水浴锅：0℃~100℃。

6.9组织研磨器或研钵。

6.10高压灭菌锅。

6.11pH计。

6.12微波炉。

6.13磁力搅拌器。

7样品的采集与处理

7.1样品采集

样品采集按照GB/T18645-2020进行。

7.1.1采样工具

无菌注射器、真空采血管、无菌的容器、无菌橡胶管、剪刀、镊子、无菌离心管、研钵。

采样工具用高压（121℃±2℃/0.1MPa）15min灭菌并烘干，或160℃干烤1h灭菌；或使用一

次性无菌用等效工具。

7.1.2血液样品

用无菌注射器或真空采血管，自动静脉采血，无菌分离血清。

用无菌注射器或真空采血管，自动静脉采血，将血液直接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混

合。抗凝剂采用柠檬酸钠缓冲液，或0.5mol/LEDTA。每6mL血液加1mL抗凝剂。条件允许时，应优先

采用全血，以更有利于富集菌体。

7.1.3乳液样品

无菌采集乳样于无菌的容器中。一般以挤出的后段乳样含菌量较多，清晨挤出的乳样含菌量最高。

7.1.4痰液样品

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清晨，用橡胶管自口腔伸入至气管内，外接注射器吸取痰液；或直接采集咳出的痰块。

7.1.5组织样品

采集动物下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门淋巴结）、纵膈和肠系膜淋巴结，以及病变组织器

官（如：肝、脾等）。

7.1.6粪便样品

采集混有黏液、血液、黏膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部（30cm）取少量黏液粪便，盛于无

菌的容器中。

7.2样品处理

7.2.1血液样品处理

取1mL～2mL全血样品，15000g离心10min，弃上清液；加等量体积灭菌双蒸水充分振荡，15000

g离心10min；弃上清液，若红细胞裂解不完全，应采用灭菌双蒸水重复洗涤；收集沉淀物，进行核酸

提取，或置于-20℃贮存备用。

7.2.2乳液样品处理

取10mL乳样，加100mLTritonX-100，振荡混匀，2500g离心20min；弃上清液，取沉淀，加1mL

0.01mol/LpH7.6PBS重悬沉淀，充分振荡混匀；将沉淀悬浮液移入微量离心管，15000g离心10min；

弃上清液，收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置于-20℃贮存备用。

7.2.3痰液样品处理

在痰液样品加入2倍～4倍体积4%氢氧化钠消化液，振荡混匀，室温放置30min，间或振荡混匀，

使其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量

4%氢氧化钠消化液直至液化完全）；15000g离心10min；弃上清液，加1mL0.01mol/LpH7.6PBS，

充分振荡混匀，15000g离心10min，弃上清液，重复本步骤一次；收集沉淀物，进行核酸提取，或置

于-20℃贮存备用。

7.2.4组织样品处理

分别从三个不同的位置取适量的组织样品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按1:5的比例加入柠檬酸钠-

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磷酸缓冲液（例：1g组织样品加入5mL缓冲液），充分研磨；加入等量4%氢氧化钠消化液，继续研磨

5min～10min，使组织液化，转移至微量离心管，充分振荡，75℃温浴0.5h～1h；取上清液（避免

吸取粗渣），15000g离心10min；弃上清液，加等量0.01mol/LpH7.6PBS，振荡混匀，使沉淀充分

悬浮，15000g离心10min，弃上清液，重复本步骤1次；收集沉淀物，进行核酸提取，或置于-20℃贮

存备用。

7.2.5粪便样品处理

取1～2g粪便样品，按1:5的比例加入4%硫酸溶液（例：1g粪便加5mL液体），充分振荡混匀，

室温静置0.5～1h；取上层约3mL液体（避免吸取粗渣），5000g离心1min，取上清液，15000g离心

10min；弃上清液，加等量0.01mol/LpH7.6PBS，充分振荡混匀，15000g离心10min，弃上清液，

重复本步骤1次；收集沉淀物，继续进行核酸提取，或置于-20℃贮存备用。

8操作程序

8.1细菌DNA的提取

在样品制备区进行。

8.1.1血液样品、痰液样品、组织样品、乳液样品中细菌DNA的提取

在处理后的沉淀物中加入50μL～100μLDNA提取液，充分振荡混匀，56℃温浴30min，98℃～

100℃加热10min，瞬时离心使液体聚集管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000g离心5min，取

上清液，直接用于PCR或贮存于-80℃备用。也可采用其他等效的商品化细菌基因组DNA提取试剂盒提取。

8.1.2粪便样品中细菌DNA的提取

在处理后的沉淀物中加入50μL～100μLDNA提取液，充分振荡混匀，56℃温浴30min，98℃～

100℃加热10min，瞬时离心使液体聚集在管底，加等体积三氯甲烷，振荡混匀，12000g离心5min，

取上清液，加入等体积异丙醇（-20℃预冷），颠倒混匀，放置5min～10min，弃上清液，室温干燥5

min；加入50μL、无DNA酶、无RNA酶水，混匀，溶解核酸，直接用于PCR或贮存于-80℃备用。也可采

用其他等效的商品化细菌基因组DNA提取试剂盒提取。

8.1.3若采用其他商业化的核酸提取试剂盒或自动化核酸提取仪提取各类样品的核酸时，请按照说明

书进行操作。

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8.2扩增试剂的准备与配制

8.2.1在试剂储存和准备区进行。

8.2.2首先将除酶混合液外的所有试剂从冰箱取出并平衡至室温。

8.2.3PCR反应液配液标准为：分别取（n+1）×19.6μLPCRMix和（n+1）×0.4μLDNA聚合酶

混合液加入到1.5mL离心管中，将离心管轻震混匀，3000g离心数秒。配好的PCR反应液必须贮存在

8℃以下，并在4小时内使用。

注：n=实际检测样本所需测试数+阳性对照测试数+阴性对照测试数。

8.2.4分装PCR反应液：PCR反应液以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

8.2.5将配制好的PCR反应管装入自封袋转移至至样本制备区。贮存在8℃以下直至样品提取处理完

毕。

8.3加样

8.3.1在样本制备区进行。

8.3.2用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴性/阳性对照5μL。立即盖严

管盖。

注：每次实验应设置阳性和阴性对照进行质量控制。

8.3.3将已加入模板的PCR薄壁反应管瞬时离心数秒，除去气泡，并转移至PCR扩增区。

8.4多重实时荧光PCR扩增及熔解曲线分析

8.4.1在扩增区进行。

8.4.2将8.3.3中加样后的反应管放入SLAN-96S荧光PCR仪中，扩增与熔解曲线分析步骤连续完成。

8.4.3.1反应程序设定如下：

体系本试剂盒反应体系设为25μL

阶段条件循环数

PCR反应

UNG酶处理50℃2分钟1

程序

预变性95℃10分钟1

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95℃15秒

PCR循环程序57℃20秒55

78℃20秒

保温40℃30分钟1

95℃2分钟

熔解分析40℃2分钟

1

程序40℃～90℃，采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道

荧光信号，连续采光，升温速率0.04℃/S

8.4.3.2程序运行完毕，将PCR薄壁反应管（闭管）取出放入密封袋，将封口封严，按污染源处理。

9结果判定

检测结果将由软件自动输出，也可进行人工判读；可参照附录B的结果判读原则进行判断。

9.1结果分析条件设定

阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体需根据仪器噪声情

况进行调整。

9.2试验成立的条件

阴性对照：ROX通道只出现79.2±1.7℃（内控熔点）的熔解峰，其它通道应无熔解峰。

阳性对照：FAM通道只出现61.3±1.5℃（结核分枝杆菌复合群特异熔点）的熔解峰；ROX通道只出现72.5

±1.6℃（分枝杆菌属特异熔点）和79.2±1.7℃（内控熔点）的两个熔解峰。其它通道应无熔解峰。

9.2.1和9.2.2要求须在同一次试验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行。

结果判定

阴性

样品在ROX通道只出现79.2±1.7℃（内控熔点）的熔解峰，其他通道均无熔解峰，则表示样品中无

分枝杆菌核酸。

阳性

9.2.1.1单一感染阳性判定

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样品在ROX通道出现72.5±1.6℃（分枝杆菌属特异熔点）和79.2±1.7℃（内控熔点）的两个熔解

峰，此时表示样品中存在分枝杆菌核酸，具体菌种可根据各分枝杆菌特异熔解峰的熔点进行判读，参考

值如下：

耻垢分枝杆菌：FAM通道81.5±1.5℃；

瘰疬分枝杆菌：FAM通道67.5±1.7℃；

结核分枝杆菌复合群：FAM通道61.3±1.5℃；

龟分枝杆菌：FAM通道54±1.5℃；

副结核分枝杆菌：HEX通道70.8±1.3℃，Cy5通道65.5±2.2℃；

堪萨斯分枝杆菌：HEX通道63.5±2.2℃；

偶然分枝杆菌：ROX通道65.3±1.5℃；

溃疡分枝杆菌或海分枝杆菌：ROX通道58.2±1.5℃；

胞内分枝杆菌：Cy5通道65.5±2.2℃；

鸟分枝杆菌：Cy5通道59.5±1.6℃；。

若没有出现以上特异的熔点，则表明样品中含有本方法鉴定范围以外的其他分枝杆菌菌种。

9.2.2混合感染阳性判定

当四个通道内，除了ROX通道的内控峰和分枝杆菌属的熔解峰以外，出现两个或者多个特异性熔解

峰，根据其熔点判读相应的菌种。包含2种或2种以上分枝杆菌的样品为混合感染样品。

9.2.3样品无效

若样品在ROX通道没有出现79.2±1.7℃（内控熔点）的熔解峰，则表示样品检测结果无效。出现这

种情况的原因可能是样品经提取后核酸中含有抑制PCR反应的杂质或者实验人员操作出现错误，经过原

因排查后可重新提取样本的核酸后复检。

9.2.4可能影响检测结果的因素

实验室环境污染、试剂污染、样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输、保存不当或试剂配制不

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准确会引起试剂检测效能下降，出现假阴性或检测不准确的结果。

10注意事项

10.1采样及样品处理过程，应防止不同样品之间通过器具、手套等的交叉污染。采样及样品处理工具

应经过高压灭菌或高温烘烤处理，一套工具仅限一个样品使用。存放样品的容器应清洗、高压灭菌或高

温烘烤处理，或使用一次性灭菌容器。

10.2实验过程，应穿工作服和戴一次性手套，勤换手套，工作服应经常清洗。

10.3使用无菌耗材。吸头、离心管、PCR管等应经过高压灭菌处理，一次性使用，不得回收清洗后重

复使用。

10.4样品处理与PCR加样应在不同的区域进行,不同区域配备独立的加样工具和用具。该区域可以是

独立的空间间隔、有紫外消毒设施的独立的设备如核酸提取工作站、PCR加样工作站、可密闭进行紫外

消毒的超净工作台、生物安全柜等。若在敞开的空间进行核酸提取或PCR加样，该空间应安装紫外灯或

配备具有等同降解核酸功能的设备如移动紫外灯、带紫外消毒功能的空气消毒净化器等。上述区域在每

次使用后应及时清洁处理，并在使用前后照射紫外30min以上。每个区域应有专门的废弃物容器，该

容器应能耐受煮沸、10%次氯酸钠溶液消毒处理。每次实验结束，应在紫外消毒前，及时清理废弃物及

消毒容器，并将该废弃物容器放回工作区进行紫外消毒。

10.5PCR反应液等试剂应按检测需求分装贮存，避免同一管试剂多次开启使用。

10.6装有核酸模板、样品或试剂的离心管在打开之前，应短暂离心，避免离心管崩开，避免产生气溶

胶。

10.7上机运行前，应检查盖紧各PCR管，以防荧光物质或模板泄漏而污染机器。

10.8应遵循基因检测实验室其他技术要求。

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附录A

（规范性附录）

DNA提取试剂的配制

A.1柠檬酸钠缓冲液

柠檬酸5.3g

柠檬酸钠15.0g

葡萄糖16.2g

称取上述试剂，溶解于蒸馏水，定容至1L，混匀。121℃±2℃高压灭菌15min，贮存于4℃。

A.20.5mol/LEDTA(pH8.0)

称取186.1gEDTA，加入到800mL蒸馏水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠调pH值至8.0

定容至1L，分装后121℃±2℃高压灭菌15min，室温贮存。

A.30.01mol/LpH7.6PBS

先配制A液、B液：

A液（0.2mol/LNaH2PO4溶液）：称取一水合磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）27.6g，或二水合磷酸

二氢钠（NaH2PO4•2H2O）31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。

B液（0.2mol/LNa2HPO4溶液）：称取十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4•12H2O）71.6g，或二水合磷

酸氢二钠（Na2HPO4•2H2O）35.6g，溶于蒸馏水中，定容至1L。

称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mLA液加87mLB液，用蒸馏水定容至1L。

A.4氢氧化钠消化液

取35g～40gNaOH，2g钾明矾，20mg溴麝香草酚蓝（预先用60%酒精配制成0.4%浓度，应

用时按比例加入），加入1L蒸馏水混匀，即为氢氧化钠消化液。

A.5DNA提取液

含100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，0.01%TritonX-100，200μg/μL蛋白酶K。可采用等效商

品化试剂。

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附录B

（资料性）

多重实时荧光PCR检测（探针熔解曲线法）

B.1试剂

B.1.1DNA提取相关试剂的配制

见附录A。

B.1.2PCRMix溶液

检测十项分枝杆菌所需的引物探针和buffer的预混液。

B.1.3DNA聚合酶混合液

检测十项分枝杆菌所需的DNA聚合酶混合液。

B.1.4扩增区域

分枝杆菌属检测扩增区域

检测区域

序列信息(5′→3′)

（以结核分枝杆菌的检测区域为例）

TCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGC

AGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT

CACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCCTAACCCTCGGGAGGG

AGCTGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGT

>CP072765.1:1473145-1473795ACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTTCTAAGGAGCACCACGAAAACGCC

MycobacteriumtuberculosisstrainCCAACTGGTGGGGCGTAGGCCGTGAGGGGTTCTTGTCTGTAGTGGGCGAGAGC

CGGGTGCATGACAACAAAGTTGGCCACCAACACACTGTTGGGTCCTGAGGCAA

H37Rv_CGchromosome,completeCACTCGGACTTGTTCCAGGTGTTGTCCCACCGCCTTGGTGGTGGGGTGTGGTG

genomeTTTGAGAACTGGATAGTGGTTGCGAGCATCAATGGATACGCTGCCGGCTAGCG

GTGGCGTGTTCTTTGTGCAATATTCTTTGGTTTTTGTTGTGTTTGTAAGTGTC

TAAGGGCGCATGGTGGATGCCTTGGCATCGAGAGCCGATGAAGGACGTGGGAG

GCTGCGATATGCCTCGGGGAGCTGTCAACCGAGCGTGGATCCGAGGATTTCCG

AATGGGGAAACCCAG

B.2多重实时荧光PCR检测

B.2.1总DNA的提取

见正文第7部分“细菌DNA的提取”。

B.2.2多重实时荧光PCR反应体系（探针熔解曲线法）

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B.2.2.1多重实时荧光PCR方法（探针熔解曲线法）原理

本方法采用荧光PCR探针熔解曲线法，其基本原理是：在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与

淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完成后增加熔解曲

线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得探针与该序列杂交

产物的熔解曲线，并得出熔点（Tm值）。因此，根据不同分枝杆菌ITS片段的特异序列设计探针，采用

特定的荧光通道和熔点进行分枝杆菌的鉴别。同时在体系中加入外源性内控模板，对扩增体系进行质量

控制。以含结核分枝杆菌的质粒材料作为阳性对照，以不含分枝杆菌的DNA溶解液作为阴性对照。

B.2.2.2多重实时荧光PCR反应体系

多重实时荧光PCR反应体系见表B.1。

表B.1PCR反应体系

名称加样量/μL

PCRMix19.6

DNA聚合酶混合液0.4

模板DNA5.0

合计25

B.2.2.3反应体系配液过程

1首先将除酶混合液外的所有试剂从冰箱取出并平衡至室温。

PCR反应液配液标准为：分别取n×19.6μLPCRMix和n×0.4μLDNA聚合酶混合液加入到1.5

mL离心管中，将离心管轻震混匀，3000g离心数秒。配好的PCR反应液必须贮存在8℃以下并在4小

时内使用。

②分装PCR反应液：PCR反应液以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。

③将配制好的PCR反应管装入自封袋转移至提取间。贮存在8℃以下直至样品提取处理完毕。

注：每次实验应设置阳性和阴性对照进行质量控制。

④用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴性/阳性对照5μL。立即盖严管盖。

⑤将已加入模板的PCR薄壁反应管瞬时离心数秒，除去气泡，并转移至PCR扩增区。

B.2.2.4多重实时荧光PCR扩增及熔解曲线分析

扩增与熔解曲线分析步骤为一个程序，在SLAN-96S荧光PCR仪上连续完成。

①反应程序设定如下：

体系本试剂盒反应体系设为25μL

PCR反应阶段条件循环数

程序UNG酶处理50℃2分钟1

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预变性95℃10分钟1

95℃15秒

PCR循环程序57℃20秒55

78℃20秒

保温40℃30分钟1

95℃2分钟

熔解分析40℃2分钟

1

程序40℃～90℃，采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道

荧光信号，连续采光，升温速率0.04℃/S

②程序运行完毕，将PCR薄壁反应管（闭管）取出放入密封袋，将封口封严，按污染源处理。

B.2.3结果判断与描述

样品检测时，检测流程及结果判定按照下述原则进行：

样品提取后采用检测试剂进行检测，同时需要检测阳性对照和阴性对照；当单次实验结果的阳性对

照和阴性对照的数值在参考值范围内，则单次实验有效，可进行样品类型的分析和判读。

B.2.3.1结果分析条件设定