微生物检验指导书

广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAA0-PG-007A-2009微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第1页文件更改记录更改单号更改页码更改内容修订版本状态更改人审核人批准人广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2009微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第2页1目的：为了确保本公司生产的产品及外购产品的微生物符合本公司的要求，使投放市场的产品符合国家卫生标准和消费者的需要，结合我公司的实际情况，特制定本规范。2．范围：本公司车间微生物控制、原料、半成品、成品。3.定义：（无）4．职责：品管部：负责车间环境、人员、水质、设备及原料、半成品、成品的微生物检验，并进行不合格产品的处理跟踪，负责及时将车间卫生指标、原料、半成品、成品的微生物控制信息反馈给工厂，防止不合格半成品进入下一道程序及不合格成品流入市场，负责对文件的整理及各种报表的统计。5检验流程：广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAA0-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第3页责任部门微生物检验控制流程说明品管部OKOKA5A6A4器皿、培养基准备灭菌取样微检操作A2工厂计划部A3合格不合格复检合格不合格出具检验报告品管部经理审核执行不合格品控制流程半成品成品空气、水原料、包材机器设备、个人卫生A1A1.检验员根据当天的《工厂日生产计划）》准备当天需要消毒的器皿及培养基的数量及培养基。A2.检验员将准备好的器皿、培养基进行121摄氏度，0.1MPa灭菌20分钟。A3.1每天上午9：00左右半成品检验员严格按照无菌操作对前一天生产的半成品或工厂发出的余料检验通知单按照半成品的取样方法进行取样。2成品由车间巡检员按照成品取样方法进行取样，下午3-4点时由微生物检验员将样品取回检验。3微生物检验员每天上午完成对灌装间的空气，个人卫生，包材容器的取样，下午完成对制作间空气、各个出水口，及工艺研发中心，品管部实验室各个去离子出水口的取样并检测.4原料检验员根据原料取样方法进行取样，根据原料检验标准对需要检微生物的原料进行分装并通知微生物进行检验.A4检测项目：为细菌总数、霉菌、致病菌（粪大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌）。检验方法见本节附件。检验完毕半成品填写《半成品检测报告》中微生物栏中内容，其它指标（如理化指标等）均检验合格后，则签署《半成品检测报告明细表》同时填写《半成品检测结果反馈单》审核后转交给工厂计划部安排灌装计划。成品检验完毕填写《成品检测报告》微生物栏中内容，待其它指标（如理化指标，净含量指标等）均检验合格后，填写《成品检测报告明细表》审核后，交工厂计划部安排成品出库。A5检测合格出检验报告经品管经理审核后交工厂计划部进入下一工序.A6检测不合格半成品、成品、样板、外购件、原料需要分析原因严格控制从取样到检测的各个程序，加严复检，复检合格，出具检验报告，复检不合格则执行＜不合格品控制流程.＞而空气、水、机器设备、个人卫生检验不合格则直接执行＜不合格品控制流程＞。广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第4页6.操作规范6.1灭菌6.1.1根据当天《工厂日生产计划》确定当天的检验项目和样品数量，对所需要的器皿（包括稀释用的生理盐水、取水及半成品的烧杯、移液管、培养皿、取样用的药匙）和培养基（卵磷脂－土温80营养琼脂培养基、孟加拉红培养基、乳糖胆盐培养基、SCDLP培养基、BP培养基、十六烷培养基等）进行高温高压灭菌；该项准备工作一般在上午八点到十点进6.2采样.1.1空气指标：采用空气沉降法分别对二次更衣室、灌装间、普通储膏间、净化储膏间、消毒包材暂存间、缓冲间、制作间、大料间、小料间、配料间进行测定。测定时间一般为周二、四、六10：30－11：00及15：00－15：30进行。其中制作间、大小料间、二次更衣室的微生物指标仅作卫生质量控制的去离子水：备无菌烧杯用无菌操作对制作间的8个出水口及品管部实验室和研究所实验室去离子水进行采样；采样时间一般为周一、三、五14：00－14：30进行人员卫生：采用生理盐水涂抹法对在灌装间进行灌装的人员及可能接触膏体人员的手部、无菌服进行采样；采样时间为周一至六10：00－11：00设备及消毒好包材：对灌装间灌装机及所有接触膏体的设备，及制作间、储膏间消毒好的储料桶及消毒包材暂存间的已消毒包材进行采样，采样方法同原料：由原料检验员用灭菌过的烧杯、勺半成品：由常规理化检验员用灭菌过的烧杯、勺到半成品成品：包装质控员依据“样板管理指导书”对每天灌装的成品进行取样，微生物检验员每天15：30供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品污染。接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在无菌室内。6.2.2若只有一个样品而同时需做多种分析，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。在检验过程中，从打开包装全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。6.3检验表1微生物检验指标检验指标要求检验方法（见附件）细菌总数见表2细菌总数的测定霉菌和酵母菌总数见表2霉菌和酵母菌测定粪大肠菌群不得检出粪大肠菌群金黄色葡萄球菌不得检出金黄色葡萄球菌绿脓杆菌不得检出绿脓杆菌广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第5页表2微生物检验项目细菌、霉菌和酵母菌数量控制标准检验项目要求/(CFU/g)检验周期参照标准细菌霉菌和酵母菌半成品≤50≤30每批次化妆品卫生规范（2007年版）成品≤50≤30每批次生产用水≤10≤3一周三次化妆品生产用水的微生物学检验原料参照原料COA每批次原料中COA要求化妆品原料的微生物检验车间空气净化标准车间——一周三次生产车间空气中的微生物检测30万级制作间≤15≤1010万级消毒包材暂存间≤10≤310万级净化储膏间≤10≤310万级普通储膏间≤10≤310万级灌装间≤10≤330万级大、小料间≤15≤1030万级二次更衣室≤15≤10生产设备及环境物体表面≤5≤3每天一次化妆品生产设备及环境物体表面微生物检验消毒包材及生产人员手部≤5≤3每天一次化妆品包装及生产人员的微生物检验工衣≤50≤5备注：a：眼部、唇部用儿童用化妆品≤5006.3.1微生物检验员按表1、表2中相关标准对样品在无菌室里生物安全柜进行无菌检验操作。6.3.2细菌总数、霉菌、致病菌（粪大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌）检验方法、所需试剂及6.3.3原料、半成品、成品第一次检测不合格者，应按无菌操作法重新取样，实行加严检验（梯度稀释，最少做三个梯度），如该检验结果为合格者则判定该样品最终检测结果为合格，否则为不合格。6.3.4复检样品应做平行样，根据第一次检验结果可加大稀释度倍数 广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第6页6.4品质验证结果的判定及处理微生物检验员将检验结果如实的填写《微生物检测原始记录表》及《原料检验报告》、《微生物检测报告（去离子水）》、《微生物检测报告（车间空气）》、《微生物检测报告（包材、容器、个人卫生）》、《微生物培养过程登记表》《半成品检测报告》、《成品检测报告》、《成品检测报告明细表》，由品管经理审核签字后存档，同时将《成品检测报告明细表》复印一份交付工厂留底。对于不合格的质量指标产品如实填写在《品质异常联络单》上，并出具不合格报告，交给品管经理审核并分析不合格原因，采取纠正措施，同时负责跟踪异常产品的处理进度。6.5检验仪器的使用参照《仪器操作规范》。6.6相关事项6.6.1对新进仪器设备如需进行微生物检验者，由工厂通知微生物检6.6.2每月6.6.3培养基的配制应如实填写在《培养基配制记录表7.相关文件：7.1《微生物细菌数量控制标准》7.2《生产车间去离子水检验标准》 7.3《化妆品卫生规范》（2007年版）7.4《化妆品微生物标准检验方法》7.5《不合格品控制程序》7.6《仪器操作规范》广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第7页8相关质量记录表格：记录名称记录编号责任部门保存期限《微生物检测原始记录表》QR/DAAO-PG-G001A-2011品管部三年《微生物检测报告（去离子水）》QR/DAAO-PG-G002A-2011品管部三年半《微生物检测报告（车间空气）》QR/DAAO-PG-G003A-2011品管部三年半《微生物检测报告（包材、容器、个人卫生）》QR/DAAO-PG-G004A-2011品管部三年半《半成品检测报告》QR/DAAO-PG-A002A-2011品管部三年半《成品检测报告》QR/DAAO-PG-D001A-2011品管部三年半《成品检测报告明细表》QR/DAAO-PG-D002A-2011品管部三年半《品质异常联络单》QR/DAAO-PG-S001A-2011品管部三年9附件9.1样品的预处理9.2细菌总数测定9.3霉菌和酵母菌测定9.4金黄色葡萄球菌的测定9.5粪大肠菌群的测定9.6绿脓杆菌测定9.7化妆品生产用水的微生物检验9.8化妆品原料的微生物检验9.9生产车间空气的微生物检测9.10化妆品生产设备及环境物体表面微生物检验9.11化妆品包材及生产人员个人卫生的微生物检验广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第8页样品的预处理化妆品样品与其他环境样品的不同之处，一是化妆品中通常都加有防腐剂；二是化妆品的剂型较多且复杂。这就给化妆品样品的预处理造成了一定的难度。1残留防腐剂的去除1.1目的由于化妆品中含有防腐剂，使被污染的微生物处于受抑制状态，如按常规的方法制备检样进行检验，往往检不出，甚至出现假阴性。因此必须去除化妆品中多余的防腐剂，使长期处于濒死状态或半损伤状态的微生物得到复苏而被检出，从而得出正确的检验结果。1.2去除防腐剂的原则1.2.1.能有效去除化妆品中残留的防腐剂。1.2.2.对微生物无害，不减少微生物的检出效果。1.2.3.不破坏培养基的营养成分，不影响其理化性能。1.3去除防腐剂的方法1.3.1化学中和法又称中和法，是在供试液或培养基中加入中和剂，将残留的防腐剂中和掉，使其不再持续抑制微生物。该方法使用做普遍，也最适用于化妆品中残留防腐剂的去除。由于防腐剂种类不同，所用的中和剂也应不同，但是目前化妆品中常用的防腐剂大多可用卵磷脂和吐温80中和，故在化妆品卫生规范中检验化妆品微生物时采用卵磷脂和吐温80中和化妆品中残留的防腐剂。根据公司产品的类型，此类样品预处理方法主要用于油包水的产品。随着化妆品工业的迅速发展，新的防腐剂不断出现，在化妆品中使用防腐剂的种类也越来越多，如何选用合格的中和剂，有待进一步探讨。1.3.2稀释法主要用于水溶性样品的稀释。用稀释液将样品稀释到一定浓度，同时也降低了残留防腐剂的浓度，以消除对微生物的抑制作用。本法的优点是任何种类的防腐剂均可应用，其缺点是稀释液过多，微生物浓度也下降，可出现假阴性结果。2供检样品的制备2.1.制备原则2.1.1.处理样品时应严守无菌操作要求，需在无菌室或超净工作台内进行操作。所用试液需灭菌，所用器皿（如三角瓶，吸管，试管，称量勺，平皿等）也均需灭菌，以免污染样品，影响检出结果。2.1.2.要使样品充分混合均匀，样品加到稀释液中后，要振荡使之混匀，以免由于染菌的不均匀分布，而影响检出结果。2.1.3.尽量做到使样品完全溶解，在不影响微生物生长的条件下，可适当加温，加某些对微生物生长繁殖不产生影响的助溶剂，使样品溶解在稀释液中，其中的微生物分散到供试液中。2.2制备方法在无菌室的缓冲间内打开并去掉化妆品的外包装盒，将样品送入无菌操作室，在开盖前将瓶内样品振荡混匀，消毒瓶盖和操作人员的手后，再打开瓶盖称量。不同剂型样品的取样和制备方法如下。2.2.1液体样品水溶性的液体样品，可量取5ml加到45ml灭菌生理盐水中，混匀后，制成1：10检液。油性液体样品，取5ml样品，先加入2ml灭菌液体石蜡混匀，再加5ml灭菌的吐温80，振荡混匀。加入38ml灭菌生理盐水，充分混匀，制成1：10检液广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第9页2.2.2膏、霜、乳剂半固体状样品亲水性的样品：称取样品5g，加到45ml装有玻璃珠的灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，静置15min，取其上清液检验。疏水性样品：称取样品5g，放到灭菌的研钵中，加5ml灭菌液体石蜡，研磨成粘稠状，再加入5ml灭菌吐温80，研磨待溶解后，加入35ml灭菌生理盐水，充分混匀，制成1：10检液。2.2.3固体样品称取样品5g，加到45ml灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液检验。广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第10页细菌总数测定细菌总数系指1g或1ml1 方法提要化妆品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它一定的生理特性，对营养、培养温度、培养时间、PH值、需氧性质有所不同。在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃培养48h2培养基和试剂2.1生理盐水（8.5‰）氯化钠8去离子水1000ml溶解后，分装到加玻璃珠的150ml锥形瓶内，每瓶45ml或90ml,121℃20min2.2营养琼脂培养基按照试剂说明书上的用法称取卵磷脂、吐温80营养琼脂干粉5.1g加去离子水100ml混合后，加热溶解，121℃101.5kPa20min高压灭菌。储存于微检室内恒温水浴锅中（水浴锅温度为55℃）2h内用完3仪器3.1锥形瓶250ml、150ml3.2量筒3.3高压消毒锅3.4试管3.5灭菌平皿：直径93.6灭菌刻度吸管：10ml、2ml3.7酒精灯3.8恒温培养箱（37±0.5℃3.9放大镜4操作步骤4.1用灭菌吸管吸取1：10稀释的检样2ml，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml。另取1ml注入到9ml灭菌生理盐水中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，使成1：10稀释液。吸取2ml，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml。如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000，1：10000，…..等，每种稀释度应换1支吸管。注意：当用吸管从检样稀释液加到另一支装有9ml空白稀释液时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧黏附的检液混入其中。将熔化并冷却至恢复到手能触摸的温度的营养琼脂倾注平皿内，每皿约15ml,另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。随即转动平皿，使样品与培养基充分混广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第11页合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48注意：为防止细菌增殖及产生片状菌落，在制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1h内操作完毕。5菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5~10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。6菌落计数及报告方法6.1首先选取平均菌落数在30~300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数6.2若有两个稀释度，其平均菌落数均在30~300个之间，则应求出两者菌落总之比值来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的菌落数。6.3若所有稀释的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.4若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数6.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。6.6若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。6.7菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。广州环大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第12页霉菌和酵母菌测定霉菌和酵母菌广泛存在于自然界中，种类极多，多数化妆品的PH值、湿度、温度及储存条件等皆适合其生长。国内有资料表明，化妆品受霉菌和酵母菌的污染相当严重。化妆品被霉菌和酵母菌污染后，不仅使其质量下降，而更重要的是有些霉菌和酵母菌及其毒素可使消费者致病，危害极大。1方法提要霉菌和酵母菌在虎红培养基上菌落典型、清晰、易观察。霉菌菌落具有放射状或树枝状的菌丝，形成的菌落多数有各种颜色。酵母菌菌落为圆形隆起，边缘整齐，表面光滑湿润，呈不透明乳脂状，粉红色，位于培养基深部的菌落可呈铁饼形、三角形或多角形。2培养基和试剂2.1生理盐水（8.5‰）氯化钠8.5g去离子水1000ml溶解后，分装到加玻璃珠的150ml锥形瓶内，每瓶量取45ml,121℃2.2虎红琼脂培养基按照试剂说明书上的用法称取虎红琼脂干粉3.16g加100ml去离子水混合后，加热溶解，121℃101.5kpa20min高压灭菌。储存于微检室内恒温水浴锅中（水浴锅温度为55℃3仪器3.1锥形瓶：250ml、150ml3.2量筒3.3高压消毒锅3.4试管3.5灭菌平皿：直径9cm3.6灭菌刻度吸管：10ml、2ml3.7酒精灯3.8恒温培养箱（28±0.5℃3.9放大镜4操作步骤4.1用灭菌吸管吸取1：10稀释的检样2ml，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml。另取1ml注入到9ml灭菌生理盐水中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，使成1：10稀释液。吸取2ml，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml。如样品含菌量高，还可再稀释成1：1000，1：10000，…..等，每种稀释度应换1支吸管。注意：由于霉菌孢子多聚积成团，故在吸取各稀释度的供试液时，需要充分振摇或用吸管反复吹打，使孢子团分散开，并均匀混悬。将熔化并冷却至恢复到手能触摸的温度的虎红琼脂倾注平皿内，每皿约15ml,另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置28℃广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第13页注意：A:恒温箱的湿度，一般湿度不低于70%，过湿霉菌会大量蔓延生长，过干则影响其生长发育。B:霉菌在适宜条件下生长迅速，很快有孢子形成，先成熟的孢子落在培养基上又可萌发长成新菌落。因此如在培养中观察时，不要反复翻转平板，以免有次生菌落形成，影响菌落计数的准确性。5菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5~10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。6菌落计数及报告方法同细菌总数相同广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第14页金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力较强，是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶，因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。1、方法提要典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10~15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。2、培养基和试剂2.1生理盐水（8.5‰）氯化钠8.5g去离子水1000ml溶解后，分装到加玻璃珠的150ml锥形瓶内，每瓶45ml,121℃101.5kpa20min高压灭菌。2.2SCDLP培养基按照试剂说明书上的用法量取3.8g的SCDLP干粉加100ml去离子水混合后，加热溶解，121℃101.5kpa20min高压灭菌。储存于微检室备用。2.3Baird-Parker氏培养基按照试剂说明书上的用法量取5.8gBaird-Parker氏培养基干粉加95ml去离子水混合后，加热溶解，121℃101.5kpa20min高压灭菌。储存于冰箱中备用（存储时间不得超过48h）。3、仪器3.1显微镜3.2培养箱3.3水浴锅3.4灭菌刻度吸管：10ml、2ml3.5灭菌试管3.6载玻片3.7盖玻片3.8酒精灯3.9接种环4.0灭菌平皿：直径9cm4、操作步骤4.1增菌培养本规范方法用SCDLP增菌液增菌。取1：10稀释的样品液5ml接种到45mlSCDLP液体培广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第15页养基中，置37°C培养箱中培养24h。4.2分离培养自上述增菌培养液中，取1~2接种环，划线接种在Baird-Parker氏培养基，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置37°C培养24~48h。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带，挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置自上述增菌培养液中，取1~2接种环，划线接种在Baird-Parker氏培养基，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置37°C培养24h.金黄色葡萄球菌特征见表：培养基菌落特征Baird-Parker琼脂血琼脂圆形隆起，光滑，直径为2~3mm,呈灰色到黑色，边缘色淡，周围为一浑浊带，外层有一透明带金黄色，圆形隆起，边缘整齐，外周有透明的溶血环，直径为1~2mm,金黄色、4.3、镜检染色挑取份纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌落较小，直径约为0.5～1µm。4.4血浆凝固酶实验吸取1：4新鲜血浆0.5ml，放入灭菌的试管中，再加入待检菌24h肉汤培养物0.5ml。混匀，放37°C恒温水浴锅中，每半小时观察一次，6检验报告按常规程序检验，凡分离出革兰氏阳性葡萄球菌的可疑菌落，经证实可发酵甘露醇、血浆凝固酶阳性的菌株，可报告检出金黄色葡萄球菌。如果分离的可疑菌落不发酵甘露醇，血浆凝固酶阳性可断定为检出金黄色葡萄球菌。如果分离出的可疑菌落不发酵甘露醇，血浆凝固酶阴性，判断未检出金黄色葡萄球菌。广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第16页粪大肠菌群的测定粪大肠菌群是一群需氧及兼性厌氧，在44.5℃培养24~48h能发酵乳糖、产酸并产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌。粪大肠菌群不是细菌分类上的名词，而是常用的一群卫生指示菌。该菌群包括大肠埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷白氏菌属、肠杆菌属等。由于粪大肠菌群主要存在于温血动物粪便中，随粪便排出体外，1、方法提要根据粪大肠菌群所具有的生物学特性进行鉴定检验。如该类细菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌；44.5℃2、培养基和试剂2.1生理盐水（8.5‰）氯化钠8.5g去离子水1000ml溶解后，分装到加玻璃珠的150ml锥形瓶内，每瓶量取45ml,121℃101.5kpa20min高压灭菌。2.2乳糖胆盐培养基按照试剂说明书上的用法量取6g乳糖胆盐培养基干粉加去离子水100ml混合后，加热溶解，121℃101.5kpa20min高压灭菌。储存于微检室备用。2.3伊红美兰（EMB）培养基按照试剂说明书上的用法量取3.75g伊红美兰培养基干粉加去离子水100ml混合后，加热溶解，121℃101.5kpa20min高压灭菌。储存于冰箱中备用。3、仪器3.1显微镜3.2培养箱3.3灭菌刻度吸管：10ml、2ml3.4灭菌试管3.5载玻片3.6盖玻片3.7接种环3.8灭菌平皿：直径9cm3.9酒精灯4、操作步骤4.1增菌培养取10ml1：10稀释的检液，加到10ml双倍浓度的乳糖胆盐培养基中，置（44.5±0.5）℃培养箱中培养24～48h，如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。1.产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置37℃培养18～24h。同时取该培养液1～２滴接种到蛋白胨水中，置44.5±0.5）℃观察产酸、产气时常可见到发酵管内有极微量的气泡，一般情况下，产气量与粪大肠菌广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第17页群的检出呈正相关。但产气泡量小并非粪大肠菌群都是阴性。当倒管中有极少量的气泡或无气泡但从液面及壁管可看到缓缓上升的小气泡时，均应做进一步的观察和鉴别。经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。粪大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈紫黑色，圆形、边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，也常为粪大肠菌群，应注意挑选。2.挑取上述可疑菌落，涂片做革兰氏染色镜检。镜检观察如菌体无芽孢、呈红色的革兰氏阴性短芽孢杆菌时，继续做靛基质试验。3.靛基质实验：在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约0.5ml，观察靛基质反应。阳性者液面呈现玫瑰红色，阴性反应液面呈试剂本色。检验结果报告按常规检验程序，凡发酵乳糖产酸产气在平板上有典型或可疑菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告每克被检样品中检出粪大肠菌群。广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第18页绿脓杆菌培养绿脓杆菌即铜绿色单芽孢菌，也称绿脓假单胞菌，可产生蓝绿色素和荧光色素。一般情况下该菌不致病，在特殊条件下可引起皮肤化脓感染、泌尿道感染、中耳炎等。外伤及烧伤患者感染后最易引起化脓，并可引起败血症。化妆品是以涂抹、喷洒或其他类似的方法施于人体表面任何部位以达到清洁、消除不良气味、护肤、美容和修饰为目的产品。为了保证消费者安全，化妆品中不宜检出绿脓杆菌。1、方法提要根据绿脓杆菌的生物学特征，革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，液化明胶，还原亚硝盐，在42℃2、培养基和试剂2.1生理盐水（8.5‰）氯化钠8.5g去离子水1000ml溶解后，分装到加玻璃珠的150ml锥形瓶内，每瓶量取45ml,121℃101.5kpa20min高压灭菌。2.2SCDLP培养基按照试剂说明书上的用法量取3.8g的SCDLP培养基干粉加100ml去离子水混合后，加热溶解，121℃101.5kpa20min高压灭菌。储存于微检室备用。2.3十六烷培养基按照试剂说明书上的用法量取3.33g十六烷培养基干粉加100ml去离子水混合后，加热溶解，121℃101.5kpa20min高压灭菌。存储于冰箱中备用。3、仪器3.1显微镜3.2培养箱3.3灭菌刻度吸管：10ml、2ml3.4灭菌试管3.5载玻片3.6盖玻片3.7接种环3.8灭菌平皿：直径9cm3.9酒精灯4、操作步骤4.1增菌培养取1：10样品稀释液10ml加到90mlSCDLP液体培养基中，置37℃培养18h～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有如检验不含防腐剂的产品或原料，可用普通肉汤培养基。4.2分离培养从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上，置37℃培养18～24h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第19页表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。在缺乏十六烷三甲基溴化铵琼脂时也可用乙酰胺培养基进行分离，将菌液划线接种平板上，放在37℃培养24h，绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其它4.3染色镜检挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者进行氧化酶试验。检验报告被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌、氧化酶及绿脓菌素实验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出绿脓杆菌。1.如果分离到的可疑似菌株为革兰氏阴性无芽孢杆菌，氧化酶实验阳性，不产生绿脓菌素，而能液化明胶，使硝酸盐还原产气和42℃生长实验阳性时，仍可报告被2.符合以下情况之一者，应报告未检出绿脓杆菌：（1）从增菌液中未分离出任何菌落；（2）分离的革兰氏阴性无芽孢杆菌氧化酶试验阴性；（3）不产生绿脓杆菌色素而氧化酶阴性的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经试验证明不能液化明胶，硝酸盐还原产气和42℃广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第20页化妆品生产用水的微生物学检验方法水在化妆品中用量极大，是化妆品的主要成分之一，水的品质对化妆品的质量有着重大影响。化妆品生产用水的处理方法一般采用过滤吸附法，点渗析法，离子交换法等，对生产用水的微生物检测指标有细菌总数，粪大肠杆菌群，霉菌和酵母菌，金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌。一、细菌总数（参照化妆品细菌总数的测定方法）菌落总数是指水样在一定条件下（营养琼脂培养基，37℃，48h1．以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，加到灭菌的平皿内，注入约15mL融化并冷却到45℃2.待冷却凝固后，翻转平皿，使其底面朝上，置于（37±1）℃培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为1mL水样中的菌落总数，以（cfu/mL）报告结果。粪大肠杆菌群（参照化妆品粪大肠菌群的测定方法）粪大肠杆菌群是作为粪便污染指标菌提出的，是指一群在44.5℃±0.5℃培养48h能发酵乳糖产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。粪大肠杆菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康潜在危害性的大小，是评价化妆品生产用水卫生质量的重要指标之一。本公司采用的是乳糖胆盐培养法1.器具、培养基处理取乳糖胆盐培养基6g，加入去离子水100ml,搅拌至完全溶解，分装于带有小导管的试管中，塞上胶塞，用牛皮纸包扎，与包扎好的平皿，10ml刻度吸管等器材一并放入高压灭菌锅中121℃101.5kpa高压灭菌20min。灭菌后的培养基立即送入微检室待用，平皿放入烘箱烘干，取出备用。2.操作步骤以无菌操作方法用灭菌吸管吸取10ml充分混匀的水样，加到灭菌的10ml双倍乳糖胆盐培养基试管内，轻轻摇动试管，使水样与培养基充分混匀。置（44.5±0.5）℃培养箱中培养24～48h。3.报告方法如不产酸也不产气，则报告为粪大肠菌群阴性。如产酸产气再做进一步的实验观察。霉菌和酵母菌（参照化妆品真菌总数的测定方法）霉菌和酵母菌广泛分布于自然界中，也可存于水中，可引起化妆品变质发霉，有些霉菌还可以产生有毒毒素，所以控制生产用水中的霉菌和酵母菌极为重要。在固体培养基上，霉菌呈放射状生长，孢子有各种颜色；酵母菌在培养基表面多呈圆形凸起，边缘整齐，表面光滑湿润，在培养基深部生长的酵母菌多呈铁饼形，三角形或多角形，在虎红培养基上是粉红色。广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第21页检验方法：吸取2mL水样，分别注入灭菌平皿中，加入融化并冷却至45℃的虎红培养基，充分摇匀，凝固后倒置于28℃培养箱中四．绿脓杆菌检验方法（参照化妆品绿脓杆菌的测定方法）称取SCDLP培养基3.8克，加入去离子水100ml，搅拌溶解后分装到试管中，塞上橡皮塞，用牛皮纸包扎好于121℃101.5kpa高压灭菌20min。2.把包扎好的平皿、吸管等放入高压灭菌锅中121℃101.5kpa3.水样的称取以无菌操作方法用灭菌吸管吸取10mL充分混匀的水样，加到10mlSCDLP液体培养基中，置37℃培养箱培养18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面有4.结果报告被检水样经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓杆菌素试验阳性，即可报告被检水样每1mL中检出绿脓杆菌；或绿脓杆菌素试验阴性液化明胶，硝酸盐还原产气和42℃生长实验三者皆为阳性时，可报告被检样品中检出绿脓杆菌；反之，可报告1mL五．金黄色葡萄球菌检验方法同上绿脓杆菌检验方法广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第22页化妆品原料的微生物检验化妆品原料种类很多，性能各异，根据其性能和用途，大体上可分为基质原料和添加剂（辅助原料）。基质原料是组成化妆品的主体或在该化妆品内起主要功能的手质，主要包括油脂、蜡类、粉类、胶质类、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂等。添加剂是赋予色、香及其他特定作用的物质，大多为天然的含有营养成分或生物活性的物质，这些成分又是微生物生长繁殖的良好营养源，在一定程度上成为微生物的培养基，因此，检验原料中的微生物很重要。1、指标菌及特定菌的选择一般原料的微生物指标菌同化妆品一样，即：菌落总数、粪大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌。粉类原料大多数是由土壤矿物质加工而成，而土壤受微生物污染严重。据资料报道，土壤中的致病菌有需氧的炭疽杆菌和厌氧的破伤风杆菌、产气荚膜杆菌等，其检出率很高，产气荚膜菌几乎达100%，恶性水肿杆菌64%，破伤风杆菌29%，肉毒杆菌6%。这些致病菌能在土壤中生存较长时间，例如炭疽杆菌的芽孢能生存15年之久；肠道致病菌可生存100~170d；结核杆菌能生存1年左右；破伤风杆菌芽孢和产气荚膜杆菌也能长期在土壤中生存。在滑石粉、高岭土、碳酸钙等粉类原料中，经常检出枯草杆菌、真菌等，因此，在粉类原料中可增加需氧芽孢杆菌、产气荚膜杆菌和破伤风梭菌指标。在某些生物性原料如动物内脏及其提取物等可增加沙门氏菌指标。样品的预处理根据原料性质的不同，选用相应的预处理方法，如油质类原料可按油性或疏水性（油包水）化妆品处理粉类原料按粉剂化妆品样品处理等。检验方法各种微生物的检验方法均与化妆品成品检验方法相同，可参见《化妆品卫生规范》中微生物检验方法和本指导书第2篇第3章中所介绍的微生物检验方法。原料与成品微生物检验方法最根本的不同点是检验原料所用的稀释液和培养基中都不含中和剂（卵磷脂和吐温-80）。如检验菌落总数用普通营养琼脂培养基，绿脓杆菌增菌培养液可用普通肉汤，金黄色葡萄球菌增菌培养液用含7。5%氯化钠肉汤，稀释液均用生理盐水。培养基4.1营养琼脂4.2虎红琼脂4.3SCDLP培养基4.4乳糖胆盐培养基广州大澳化妆品有限公司章节号ISO9001：2008之8.2.4编号WI/DAAO-PG-007A-2011微生物检验指导书版次A/0页码共25页，第23页生产车间空气中的微生物检测化妆品生产车间的空气洁净度直接关系到化妆品的质量，所以建立常规的车间空气质量监测系统，及时进行空气净化，可有效保证化妆品达到卫生要求。本公司现采用的是以下检测方法：自然沉降法自然沉降法是利用空气微生物粒子的重力作用，在一定时间内将微生物粒子收集到带有培养基的平皿内，在适宜的温度下培养生长成为菌落并进行生物学观察、计数和评价。本方法较撞击法经济简便，不需特殊采样器，但此方法的检测结果受空气气流和带菌颗粒大小的影响较大，所收集的只是一部分较大的微生物粒子。车间空气检测步骤1.根据待测空间的大小及通风口的位置选择有代表性的点采样，通常设5个或3个采样点，采样高度为1.2~1.5m,采样点应离墙1m以上,并避开空调、门窗等空气流通处。2.将直径9cm的营养琼脂平板与虎红琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露10~30min（根据空气的洁净度）后，盖上皿盖，翻转平板，置37℃细菌培养箱内培养48h，置28℃3.结果报告根据每