DB21T 3787-2023 非洲猪瘟病毒LAMP目视检测方法

ICS11.220CCSB4121IDB21/T3787—2023前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4缩略语 5生物安全基本要求 6方法原理 7设备、试剂和材料 28检测步骤 2附录A（规范性）溶液制备 4DB21/T3787—2023本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省农业发展服务中心、中联瑞（北京）生物科技有限责任公司。本文件主要起草人：兰德松、于本良、顾贵波、曹际娟、周维、赵培、葛忠源、张雅为、孙世宇、杨作丰、刘贺、杨国丽、张春姝。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话文件起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市沈北新区人和街95号），联系电话1DB21/T3787—2023非洲猪瘟病毒LAMP目视检测方法本文件规定了非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）LAMP目视检测方法的生物安全基本要求，方法原理，设备、试剂和材料，检测步骤等技术内容。本文件适用于非洲猪瘟的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪全血、脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓、拭子等样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）Bst：嗜热硬脂芽孢杆菌（BacillusStearothermophilus)DEPC：焦炭酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate）EDTA-2Na：乙二胺四乙酸二钠（EthyleneDiaminetetraaceticAcidDisodium）LAMP：环介导等温扩增技术（Loop-mediatedIsothermalAmplification）RM：反应液（ReactionMaterial）5生物安全基本要求进行ASFV检测活动时，应按照GB19489规定执行。6方法原理针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，并引入环引物加快反应，在链置换DNA聚合酶的作用下，基因模板、引物、链置换型DNA合成酶等在60℃~65℃进行恒温扩增，15min～60min左右即可实现109倍～1010倍的核酸扩增。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，经钙黄绿素染色，呈现绿色肉眼可见的沉淀物。2DB21/T3787—2023二级生物安全柜、高速台式冷冻离心机、组织研磨仪、冰箱(2℃~8℃和-20℃以下)、金属浴或恒温水浴锅(25℃~100℃)、微量移液器(量程：0.5μL~10μL、2μL~20μL、20μ8.2.1血液样品：按照NY/T541-2016中第6.1条中猪血液样品采集的要求进行，将采集的血液注入含1/10体积4%EDTA-2Na溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备检。8.2.2脏器、组织样品：按照NY/T541-2016中第6.2条和6.3条中的要求进行，将采集的病死3在试剂配制区进行。设所需PCR管数为n(n=待测样品数+1管阴性对照+1管阳性对照)。按n+2×反应液(RM)总体积8.6.2加样向上述编号的PCR管中分别加入制备的阴性对照核酸、阳性对照核酸和样本核酸各2μL,扣紧混8.6.3PCR扩增检测8.7结果判定8.7.1质量控制8.7.2结果判定4DB21/T3787—2023（规范性）溶液制备A.1引物的名称和序列引物的名称和序列见表A.1。表A.1引物名称和序列AGGGGTTACAAACAGGTTATTGATGGGAGTCATTAATGAAATACACAACCTTTTTGTAAAACGCGTATTGTTGGTGA.2引物混合物的制备取引物对（内引物FIP、内引物BIP、外引物F3、外引物B3、环引物LB）干粉，按引物说明书分别加入适量无菌纯化水，溶解混匀，得到各引物溶液，置-20℃保存。A.32×反应液（RM）的制备本方法采用的2×反应液（RM）为商品化的2×反应液（RM）。A.4Bst2.0DNA聚合酶的制备本方法采用的Bst2.0DNA聚合酶为商品化的Bst2.0DNA聚合酶。A.5荧光染料的制备本方法采用的荧光染料为商品化的荧光目视检测试剂。A.6阳性对照采用核酸蛋白质分析仪测定阳性质控品浓度，计算质粒拷贝数，用无菌纯化水将其稀释为103