动物疫病鉴别检测技术 第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群-地方标准编制说明

1《动物疫病鉴别检测技术第3部分：禽腺地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源2019年9月4日，山东省市场监督管理局发布《2019年度标准化综合改革暨“山东标准”建设计划项目》（鲁标改办发〔2019〕6号），本标准任务来源于其中的“乡村振兴标准化建设项目”，名称为“Ⅰ群禽腺病毒通用PCR检测方法”，由山东省畜牧兽医局提出并组织实施、山东省畜牧业标准化技术委员会归口，山东省滨州畜牧兽医研究院牵头组织编制。（二）起草单位、起草人及任务分工本标准起草工作由山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司承担。本标准制定首先成立了标准起草小组，拟定了标准起草工作方案、技术路线、人员分工和计划进度等，具体人员分工如下。2定临床诊断及样（三）起草过程1、材料收集2019年检索和查阅国内外相关文献资料，搜集了相关畜禽疫病诊断的国家标准、行业标准、地方标准及团体标准等，根据禽腺病毒Ⅰ群主要血清型毒株、禽腺病毒Ⅲ群唯一成员减蛋综合征病毒（eggdropsyndromevirus,EDSV）流行情况以及基因组序列差异性的特点，分析比较了现有动物疫病检测方法的优、缺点，确定了聚合酶链式反应（PCR）是适合实验室的检测方法。2、病原与流行病学调查10）、D（FAdV-2、3、9、11）、E（FAdV-6、7、8a、8b）3鸭、鹅、鸽子以及珍珠鸡、雉鸡、鹦鹉、鸵鸟等野生禽类，引起鸡、鸭、鹅等多种家禽或野禽的典型临床症状，包括心包积水综合征、包涵体肝炎、坏死性胰腺炎和肌胃糜烂症以及呼吸道疾病等病症。禽腺病毒Ⅰ群12个血清型成员绝大部分均能够引起包涵体肝炎。Ⅲ群唯一成员EDSV和Ⅰ群具有部分相同群抗原，被列为严重危害养鸡业的4种主要病毒性传染病之一，其易感宿主包括鸡、鸭和鹅等。本项目组自2014年禽腺病毒Ⅰ群引起的疫病暴发以来，对其临床症状、流行病学、临床发病特点、病毒遗传进化演变、综合防控技术等进行了深入研究，发现，不同品种不同日龄的鸡均能发病，死亡率因血清型不同或者毒力差异而存在较大差异，最高达80%，对养禽业造成了严重损失。项目组自肉鸡、蛋鸡、樱桃谷鸭、麻鸭等病死禽分离获得70余株禽腺病毒Ⅰ群，并就部分毒株的生物学特性、致病特性、主要结构蛋白Hexon基因序列、DNA聚合酶基因及部分毒株基因组进行了研究分析，参考文献报道方法进行病毒血清型分型，同时，结合国内相关研究报道，发现国内目前流行毒株主要有FAdV-1、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b及FAdV-11等血清型。因此，建立一种可以通用检测Ⅰ群的PCR检测方法并实施标准化非常重要，对于开展该群病毒的诊断起到重要作用。同时，我国养禽业主要包括鸡、鸭、鹅、鸽子等，禽腺病毒Ⅰ群和Ⅲ群易感宿主均包括鸡、鸭、鹅等禽类，是影响我国养禽业健康发展的重要病原，且二者具有部分相同群抗原，因此，有必4要针对Ⅰ群、Ⅲ群开展鉴别检测，对防控禽腺病毒感染具有重要意义。3、检测方法建立与复核毒DNA聚合酶、20株病毒100K蛋白基因序列，比对分析后选择DNA聚合酶、100K蛋白基因保守区域分别设计了3对、1对PCR检测引物，经敏感性、特异性和重复性等验证，从中筛选出1对以DNA聚合酶基因为靶标的检测引物，对反应条件进行了优化，建立了一种可通用检测禽腺病毒Ⅰ群的敏感、特异、快速的PCR检测方法，并进行了临床样品的应用检测验证，确保方法的准确性。同时，针对EDSVDNA聚合酶基因设计了7对引物，并初步筛选出4对扩增相对高效的引物，然后与筛选的Ⅰ群检测引物进行双重扩增，最终筛选出能够开展双重鉴别检测的引物组合。将该双重PCR检测技术实施标准化后，委托3家单位对《动物疫病鉴别检测技术第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群》标准进行相关样品复核验证，反馈结果表明：标准文件中鉴别检测技术敏感、特异，具有很好的重复性，可有效鉴别检测禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群。4、标准编写过程2019年11月-2019年12月，成立标准起草组，召开项目协调会，根据前期调研论证和检测方法建立的结果，开始5编写《动物疫病鉴别检测技术第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群》征求意见草案稿。2020年1月-2020年6月，根据我国流行毒株情况，进行了进一步试验验证及相关数据分析，对征求意见草案稿进行修订、完善，形成《动物疫病鉴别检测技术第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群》的征求意见稿。2020年7月-2022年2月，对征求意见稿进行项目专家函审，广泛征求意见；收集、汇总专家修改意见，形成了标准预审征求意见。继续反复试验验证，完善检测技术方法，根据草案稿函审意见对此标准进行了修改与完善，形成《动物疫病鉴别检测技术第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群》送审稿。依据专家意见对标准及编制说明文本进行修改。2023年2月，召开地方标准审查会议，邀请9位专家对标准案进行整体审查，包括题目、前言审查，范围、规范性引用文件、术语与定义等审查，试剂或材料、仪器设备审查，结果判定审查，附录审查及检测技术审查。2023年3月-2023年7月，依据专家审查会意见对标准及编制说明文本进行修改与完善，形成《动物疫病鉴别检测技术第3部分：禽腺病毒Ⅰ群与禽腺病毒Ⅲ群》报批稿，并申请山东省地方标准报批。6二、地方标准制定目的和意义卡拉病”，也有报道称是FAdV-4与11血清型共感染所致；Ⅰ群12个血清型绝大部分均能够引起包涵体肝炎，且存在准包括河北省地方标准：《禽腺病毒4型PCR检测方法》；安徽省地方标准：《I群血清4型禽腺病毒核酸山东省地方标准：《I群禽腺病毒感染诊断技术第1部分：腺病毒感染间接ELISA诊断技术》、《禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法》。可见，与本标准文本类似的分子生物学检测方法均是FAdV-4PCR或者荧光定量PCR检测或诊断技术，但危害养禽业较为严重的血清型不仅有FAdV-4型，还有8a、8b、11等，本标准针对禽腺病毒Ⅰ群血清型多的特点，筛选了1对可通用检测的PCR引物，目前尚没有相关的分相同群抗原，均是危害我国鸡、鸭、鹅等禽养殖健康发展的重要病原，因此，建立禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群的鉴别检测技术对于开展精准防控等具有重要意义。本标准制定的禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群PCR鉴别检测技术，最大特点是利用2对引物，其中1对能够通用71对能够检测Ⅲ群，然后通过双重PCR达到鉴别检测Ⅰ群与Ⅲ群的目的，且具有敏感、特异、操作简便等特点，适用于实验室开展鉴别检测，为早期检测、流行病学调查等提供一种有效的规范性标准，对临床疫病诊断、流行病学调查等具有重要指导意义。三、地方标准编制原则、主要技术内容和确定依据（一）标准的编写原则标准化文件的结构和起草规则》与《标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素的确定方法》给出的规定起草，主要遵循“规范性、实用性、一致性和协调性”的原则，注意标准的经济性和社会效益。1、规范性本标准针对开展禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群鉴别检测的文件使用者原则，从操作过程到结果判定均给出了明确的规范，保证了规范性要素中的内容是特定使用者所需要的。2、实用性文件内容的表述便于直接应用于禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群的鉴别检测。3、一致性和协调性本标准各部分之间，关于禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群鉴别检测的结构表述一致，能够帮助文件使用者理解文件；同时，与现行有效的文件相互协调，没有重复和不必要的差异。8（二）主要技术内容和确定依据本项目组主要针对病毒DNA聚合酶基因检测进行了相关研究。该基因大小约3.7～3.9kb，核苷酸序列比较分析显示，Ⅰ群种间同源性69%以上，且同种（含有2个或以上血清型成员的）不同血清型之间高度保守，且均与Ⅲ群唯一成员EDSV存在较大差异，核苷酸序列同源性均在50%以下。因此，本项目组针对禽腺病毒Ⅰ群DNA聚合酶基因设计了3对引物，理论上可实现对该群所有成员的通用检测，同时，还针对100k蛋白基因设计了1对理论上也可实现通用检测的引物，并与文献报道检测FAdV-4DNA聚合酶基因以及Hexon基因通用扩增的PCR方法进行比对，成功筛选出1对以病毒DNA聚合酶基因为检测靶标的引物，即DNAPoLy-F1/R1，建立了一种特异、敏感的Ⅰ群通用PCR检测方法；同时，自7对EDSVDNA聚合酶基因检测引物中筛选出能与Ⅰ群鉴别检测的双重PCR引物组合。筛选或比较的引物序列见表1。对5对组合引物浓度进行筛选，自底到高分别为0.625基因检测引物在各浓度均扩增效果较差，不再用于本标准后续检测研究。同时，引物浓度为5.0μM、10.0μM，均能高效扩增，且显著高于其他浓度，并选择10.0μM引物浓9度开展后续检测研究。制备禽腺病毒Ⅰ群DNA聚合酶基因质粒标准品，并对标板，筛选检测引物的扩增敏感性，结果见图2。可见4对引物组合以DNAPoLy-F1/R1敏感性最好，且检测在1×102拷贝检测阳性，因此选择该引物组合用于本标准检测技术制定。1234ATGGGYATGTGGCARCAAGC569EDSV958FA：DNAPoLy-F1/R1；B：FAdV-4-F/R；C：DNAPoLy-F2/R2；D：DNAPoLy-F3/R3；E：100K-F/RM1：DL2000PlusDNAMarker；M2：DL2000DNAMarker；M3：DL5000DNAMarker；1-5：引物浓度10.0μM、5.0μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM；6：阴性对照A：DNAPoLy-F1/R1；B：DNAPoLy-F2/R2；C：DNAPoLy-F3/R3；D：FAdV-4-F/RM1：DL2000PlusDNAMa1-7：模板稀释倍数107、106、105、104、103、102、1011.3PCR扩增条件的优化对PCR扩增体系进行优化，包括50℃~65℃梯度退火温度、10μL～30μL扩增体积等，并对国内外常用在售PCRMix产品进行扩增效率对比实验，最终确定本标准检测技术最优扩增体系。退火温度优化结果（图3）显示，当退火温度在50.4℃~64.7℃,均能够特异性扩增目的基因，其中50.4℃~61.0℃区间退火温度扩增效率无明显差异，均适用于扩增检测，62.7℃~64.7℃区间扩增效率明显下降，且有非特异性扩增，因此，并选择55.0℃用于本标准检测技术。L、25μL、30μL扩增体系均能够高效扩增，但10μL~20μL体积存在非特异扩增与引物二聚体，当扩增体积为25标准检测技术。不同公司PCRMix扩增结果（图5）显示，5家公司PCRMix均能有效扩张，并选择扩增效率较高的国内某公司PCRMix用于本标准检测技术。同时，选择国外与国内共2家公司市售病毒DNA提取试剂盒进行比较，以提取FAdV-4病毒基因组为模板，扩增产物无显著差异。将筛选的引物、优化后扩增条件对A、C、D、E种标准（FAdV-4）、D种（FAdV-11）、E种（FAdV-8b）重组质粒标准品检测敏感性均为2×101拷贝，本标准检测技术敏感。M：DL2000DNAmarker；1-10：退火温度在64.7～50.4℃范围扩增产物；11：阴性对照图3退火温度对PCR扩增的影响M：DL2000DNAmarker；1：阴性对照；2-6：10、30μL体积扩增产物图4扩增体积对PCR扩增的影响M：DL2000DNAmarker；1、3、5、7、9：阴性对照；2、4、6、8、10：5家Mix扩增产物图5不同公司对1CR扩增的影响）；）；）；M：DL2000DNAmarker；1-8：标准质粒含量2.0×108～2.0×101拷贝的PCR产物；9：阴性对照对禽腺病毒Ⅲ群EDSV、马立克病毒（MDV）、鸡痘病毒（APV）、FAdV-4等4种常见的能感染鸡的DNA病毒进行特异性检测，结果见图7，仅对FAdV-4检测阳性，特异性好。M：DL2000DNAmarker；1：阴性对照；2-5：EDSV、MDV、APV与FAdV-4扩增产物1.6病毒组织分布检测应用本标准检测技术与文献报道的共计3种PCR方法对人工感染SPF鸡脏器组织病毒分布进行比较检测，本标准检测技术对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃与肌肉样品检测结果均为阳性，并且较FAdV-4-F/R、FAdV-Hexon-F/R文献引物敏感，检测比较结果见表2。表2PCR方法对病毒组织分布的检测结果比较+++–+–+––––––2、禽腺病毒Ⅲ群检测技术确定依据2.1禽腺病毒Ⅲ群检测引物组合与退火温度优化针对禽腺病毒Ⅲ群EDSVDNA聚合酶基因保守区域设计了7对引物，以EDS-76毒株基因组DNA为模板，进行不同退火温度（53℃、55℃、57℃）条件下PCR扩增引物的筛选，结果EDSV1446F/1794R与EDSV1446F/1833R组合扩增效率明显优于其他3对，且在53℃、55℃退货温度条件下均能高效扩增，能够与禽腺病毒Ⅰ群PCR检测技术选择的退火温度匹配。同时，选择国外与国内共2家公司市售病毒DNA提取试剂盒进行比较，以提取EDS-76病毒基因组为模板，扩增产物无显著差 M：DL5000DNAmarker；1-7：EDSV563F/815R、EDSV563F/913R、EDSV958F/1314R、EDSV1446F/1754R、EDSV1446F/1794R、EDSV1446F/1833R、EDSV2045F/2342R引物组合在不同退火温度（53℃、55℃、57℃)扩增产物图8禽腺病毒Ⅲ群PCR引物初步筛选结果2.2敏感性检测制备EDS-76DNA聚合酶基因标准品，对筛选的4对引物扩增敏感性进行比对，结果见图9，对重组质粒标准品检测敏感性均为1×102拷贝，无显著差异。2.3特异性检测对禽腺病毒Ⅰ群主要成员（A种FAdV-1、C种FAdV-4、D种FAdV-11、E种FAdV-8b）、MDV、APV与EDS-76等常见的能感染鸡的DNA病毒进行特异性检测，结果见图10，仅对EDS-76检测阳性，特异性好。将筛选的Ⅰ群检测引物与Ⅲ群4对检测引物分别进行双重PCR扩增，反应程序为94℃预变性5min，之后进行94℃最后72℃延伸10min。结果见图11，可见，Ⅰ群检测引物与Ⅲ群检测引物EDSV1446F/1754R扩增产物大小差异最显著且扩增效率无显著差异，选择作为本标准检测技术的引物。基于此，建立了禽腺病毒Ⅰ群与Ⅲ群鉴别检测PCR技术，并制定了检测标准。ABCA：EDSV958F/1314引物组合；B：EDSV1446F/1754R引物组合；C：EDSV1446F/1794R引物组合；D：EDSV1446F/1833R引物组合M：DL2000DNAmarker；1：阴性对照；2-9