测序与疾病研究系列01高通量测序技术在人体微生态研究中的应用

®高通量测序技术在人体微态研究中的应用解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金牌01020304人体微生态研究前沿微生态组学介绍研究思路与案例分享取样方法CONTENTS课程目录微生态研究前沿01微生物具有维持生态系统平衡、多样性的重要功能，并与人类/动/植物健康、环境和食品安全等诸多方面密切相关解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金微生牌物组微生物组生活在某一生境（土壤、大气、水体、人体、动/植物等）中微生物的总和。研究微生物 解读大世界解

螺

旋

|陪伴医生科研成长微知生识物金组牌计划巴西微生物组计划美国国家微生物组计划(NMI)非洲土壤微生物组计划2016年微生物组计划2017年微生物组计划2017年12月-中国科学院微生物组计划聚焦微生物组的功能网络解析与调节机制创建微生物组功能解析技术与计算方法学建设中国微生物组数据库与资源库2017年10月-全球微生物基因组测序计划计划完成超过覆盖人体、环境、海洋等主要方向的1000个微生物组样本测序建立微生物基因组、微生物组资源共享和挖掘的国际标准体系建立全球权威的微生物组学参考数据库和数据分析平台DOI：10.1021/acsnano.5b07826;

10.1007/978-3-319-59997-7_1;

10.1038/539152a解螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金牌人体微生态IF：29.886目前对人体微生物组的认知①人体菌群已证实与多种疾病相关，菌群研究正从描述和关联性研究，向机制和应用性研究转变；②每个人高度个性化的菌群受许多因素共同影响：发育早期的遗传和免疫互作、所处身体部位、饮食、抗生素、生活方式；③人体菌群不断发生着动态变化，弹性和稳定性在不同时间尺度上并存，菌群的变化率存在个体差异；④研究菌群在疾病中的作用机制应注意：深入菌株层面，在人群研究中鉴定疾病相关菌群特征并用动物实验验证，菌群本身可作为疾病标志物；DOI:

10.1038/nm.4517解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长Hooper

LV

et

al.,

Science,

2001;

Sender

R,

et

al.,

Cell,

2016;Lynch

S

V,et

al.,

New

England

Journal

of

Medicine,

2016.知识金牌肠道菌群——尚待被认知的器官肠道微生态：菌群+宿主的互作统一体人体重1-3%由细菌组成人体粪便干重50%以上为细菌及其“尸体”人肠道微生物：常见1000多种肠道细菌：约4×1013个99%以上由30-40种细菌构成健康人肠道共生菌占99%以上肠道非冗余基因集：11.4

million肠道微生态促进营养吸收改善肠易激症状增强免疫功能防治肿瘤疾病缓解肠道炎症调节血糖血脂①有益菌（如F.prausnitzii）寄生在表皮细胞粘膜层时，其分泌的短链脂肪酸（SCFA）进入细胞，会激活免疫抑制细胞（如T辅助细胞），阻断炎症反应的发生；②当有益菌缺失或致病菌存在时，粘膜屏障会被破坏，粘膜层变薄、细胞间隙扩大，病原菌极其有毒代谢物进入细胞内，从而激发炎症反应。解

螺

旋

|陪伴医生科研成长知识金牌DOI：10.1038/518S3a;10.1056/NEJMra1607547IF：40.137IF：72.406IBD：炎症性肠病（UC、CD）IBS：肠易激综合症肠道微生态解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科研成长知识金牌IF：30.41DOI：10.1016/j.cell.2016.10.027肠道微生物通过多种直接或间接机制向大脑传递讯息肠道菌群影响血脑屏障、髓鞘、神经形成，小胶质细胞成熟等基础性神经发育进程，调控动物的多种行为在焦虑、抑郁、认知缺陷和自闭症中，肠道与大脑联系密切中枢神经系统和肠道微生物组血脑屏障神经形成小胶质细胞髓鞘形成肠道微生态医生科研成长解

螺

旋

| 陪

伴B.

Sampaio-Maiaet

al.,Oral

Microbiome

in

Health

and

Disease.

2016；Baker

J

Let

al.,Trends

in

Microbiology,2017知识金牌口腔微生态口腔不同部位常见菌群不同口腔微生物类群之间和内部互作冠心病与口腔菌群口腔是人体菌群多样性最高的部位之一，与人体健康息息相关解螺旋|长知识金牌呼吸道微生态陪伴医生科研成10.1038/nrmicro.2017.14；10.1016/j.chom.2017.03.011呼吸道菌群：呼吸道健康的守门人Oh

J

etal.,

Cell,2016;

BrandweinM

etal.,

npj

Biofi解lm螺s

an旋d

Mi|crob陪iom伴es医,20生16科;E研ger成tM长et

al.,Clinical

Pharmacology

&

Therapeutics,2017;CampbellDJ

et

al.,

Cell

Host

&

Microbe,2017知识金牌皮肤菌群与肥大细胞互作，防止病原体入侵皮肤健康人群与过敏性皮炎皮肤菌群皮肤菌群调节皮肤免疫系统，维持皮肤稳态皮肤的微生物可能通过特定产物如抗菌肽的释放、代谢或直接捕获树突细胞发挥作用皮肤微生态解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科研成长知识金牌常

见

菌

包

括

乳

酸

杆

菌

（Lactobacillus）、普氏菌属（Prevotella）、链接菌属（Streptococcus）、阴道加德菌（gardnerella vaginalis）、纤毛菌属（Sneathia）。乳酸菌（Lactobacillus）作用：产生乳酸，降低阴道pH，抑菌和杀菌作用；生殖系统微生态解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌IF：37.205肠道菌群与疾病治疗肿瘤免疫治疗，基于菌群的精准医疗时代来临DOI：10.1126/science.aar2946①临床前动物模型中，细菌可调节化疗及免疫疗法的抗癌效果，近期研究关注人体肠道菌群对抗癌药物的影响②PD-1单抗对于肺癌、肾癌等上皮细胞肿瘤的疗效受肠道菌群影响，抗生素显著降低患者的平均生存期，Akk菌可能改善PD-1单抗的疗效③PD-1单抗治疗黑色素瘤的效果与肠道菌群组成相关，柔嫩梭菌丰度较高的患者无进展生存期较长④PD-1单抗治疗转移性黑色素瘤的效果与肠道菌群相关，长双歧杆菌、产气柯林斯菌和屎肠球菌的丰度影响疗效知识金牌解螺旋|青霉素诱导幼鼠肠道菌群及行为改变陪伴医生科研成长大有可为的二代益生菌菊粉或能预防小鼠的心血管疾病饮食、益生菌和药物等调节肠道菌群蔓越莓调节肠道菌群，降低心血管疾病风险？

宏基因组方法研究乌龙茶多酚对高脂饮食诱导的肥胖小鼠肠道菌群结构和功能的影响解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌微生物多样性：群落中有哪些微生物？宏基因组：这些微生物能干什么？宏转录组：这些微生物要干什么？多组学：这些微生物为什么这么干？高通量测序微生态组学介绍02解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长微生物知多样识性金研究牌16Sgenome

size:~5Mb微生物多样性测序（又称扩增子测序），是利用二/三代测序平台，对16S

rDNA/18SrDNA/ITS/功能基因等的特定PCR产物进行高通量测序，突破传统微生物不可培养的缺点，获得环境样本中的微生物群落结构、进化关系以及微生物与环境相关性等信息。常见Marker

gene：细菌：16S真菌：ITS，18S功能基因：AOA，AOB，nirK，nifH，McrA解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金牌测序引物选择-Illumina

MiSeqPlatform解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金牌同一客户项目同一实验员，同一方法，同一条件，同一流程微生物多样性测序分析流程解螺旋|陪伴医生科研成长交互式云平知台识分金析牌生物信息挖掘进入交互时代http://www.i-/宏基因组云平台强势来袭，全面上线！解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金牌微生物多样性分析流程知识金牌1、物种注释与评估数据优化统计OTU聚类分类学分析Pan/Core物种分析α多样性指数分析α多样性指数差异检验稀释曲线分析2、物种组成分析物种Venn图分析群落Heatmap图群落Bar图群落Pie图多级物种Sunburst图Circos样本与物种关系图稀释曲线判断测序深度是否足够多样性指数差异检验解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长物种Venn图分析微生物多样性分析内容解螺旋多级|

物种陪S伴un医b生ur科st图研成长知识金牌群落Bar图群落Pie图Circos样本与物种关系图群落Heatmap2、物种组成分析物种Venn图分析群落Heatmap图群落Bar图群落Pie图多级物种Sunburst图Circos样本与物种关系图微生物多样性分析内容解螺旋|陪伴医生科研成长ANOSIM/Adnois知识金牌3、样本比较分析样本层次聚类分析PCA主成分分析PCoA主坐标分析NMDS非度量多维尺度分析ANOSIM相似性分析ANOSIM相似性分析Adonis多因素方差分析PLS-DA偏最小二乘判别分析NMDS样本层次聚类树PCoAPCA微生物多样性分析内容解螺旋知识金牌LEfSe分析属门4、物种差异分析LDA

Effect

Size(LEfSe

分析)Ternary三元相图MetagenomeSeq分析多组物种差异分析两组物种差异分析两样本物种差异分析两样本差异分析|

陪伴医生科研成长两组物种差异分析多组物种差异分析微生物多样性分析内容解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金牌5、关联与模型预测分析(层级)相关性Heatmap图RDA/CCA分析Mantel

Test分析Network网络分析样本与物种的共线性关系图随机森林分析ROC曲线环境因子排序回归分析SourceTracker分析RDA/CCA分析物种物种相关性网络图环境因子相关性Heatmap图随机森林分类ROC曲线微生物多样性分析内容解

螺

旋

| 陪

伴医生科研成长知识金牌7、16S功能预测COG功能预测KEGG功能预测KEGG

pathway微生物多样性分析内容解

螺

旋

|陪伴医生科研成长知识金牌如何从大量的多样性样本中挑选代表性样本做宏基因组？多样性宏基因组MicroPITA解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌全球宏基因组研究现状DOI：10.1007/s00294-017-0693-8全球宏基因组文章发表统计1580篇Manor

O

et

al.,

Cell

Host

&

Microbe,

2017.解

螺

旋

|陪伴医生科研成长知识金牌宏基因组宏基因组(Metagenome)：生态环境中全部微小生物的基因组(Handelsmanetal.,1998)。16SMetagenome多样性宏基因组物种组成√√物种丰度√√基因预测×√功能注释×√代谢通路×√功能分析×√……解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌物种与功能注释物种与功能分析宏基因组测序分析流程测序流程分析流程解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌宏基因组分析内容1、物种与功能注释物种分类学注释COG功能注释KEGG功能注释碳水化合物活性酶注释抗生素抗性基因注释毒力因子注释PHI病原与宿主互作注释KEGG

Pathway注释物种分类注释COG功能注释碳水化合物活性酶的注释 比对CAZy数据库，适用于木质纤维素分解、糖代谢、食草动物瘤胃等相关研究。抗生素抗性基因的注释 比对ARDB/CARD数据库，适用于抗生素、抗菌剂、环境治理等方面的研究。研究思路与案例分享03解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌Doi:10.1038/nrmicro3451研究思路IF：23.574解

螺

旋

| 陪

伴

医

生科研成长知识金牌DOI：10.1038/nrmicro.2016.83IF：24.727研究思路解螺旋|陪伴医生科研成D长OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知识金牌样本：粪便样本(n=25+32)检测方法：16S多样性&q-PCR渐冻人(肌萎缩性侧索硬化ALS)粪便菌群与健康人无异IF：5.117文献案例1-渐冻症解螺旋|陪伴医生科研成D长OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知识金牌ALS患者与健康人群基本信息ALS患者与健康人群有相似的年龄、性别比例和BMI。(Functional

vital

capacity)解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科研成D长OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知识金牌ALS患者与健康人群菌群多样性ALS患者与健康人群细菌总量无显著 差异(P=0.91)；ALS患者与健康人群菌群多样性(α多 样性)无显著差异(P=0.199)；ALS患者与健康人群菌群组成(β多样 性)无显著差异(P=0.42，PERMANOVA:r2=0.02)；解螺旋|陪伴医生科研成D长OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知识金牌ALS患者与健康人群菌群组成共检测到336个genus，ALS患者与健康人群菌群无显著差异(仅uncultured Ruminococcaceae在2组间差异显著，P=0.027)；解

螺

旋

| 陪

伴

医生科研成D长OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知识金牌ALS患者与健康人群菌群功能组成ALS患者与健康人菌群在功能组成上 无显著差异；解螺旋|陪伴医生科研成D长OI:

10.1016/j.neurobiolaging.2017.09.023知识金牌案例分析内容解螺旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金牌测序项目：多样性测序平台：Illumina

MiSeq

PE300样本类型：粪便样本数量：193分组设置：实验组、对照组、验证组测序量：平均每个样本34,661cleanreads/10.1136/gutjnl-2016-313332美吉客户文章仁济医院马雄团队IF=

16.658原发性胆汁性胆管炎患者肠道菌群改变并可以在UDCA治疗后部分恢复文献案例-原发性胆汁性胆管炎解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌PBC初治患者肠道菌群失调与健康人相比，PBC初治患者肠道菌群丰度降低；PBC初治患者与健康人肠道菌群能够明显分离出来；物种丰度可以解释菌群在PC1轴上的差异。PERMANOVA，p=0.001肠道菌群诊断模型能够准确区解分螺PB旋C患|者陪和伴健医康生人科研成长知识金牌利用12种PBC相关的属作为标记微生物区别疾病状态AUC=0.86AUC=0.84实验组验证组健康人富集PBC患者富集解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌UDCA治疗使得PBC肠道菌群失调部分改善PBC

富集的属Haemophilus,Streptococcus和Pseudomonas在UDCA治疗后显著降低；健康人中富集的四种属，有三种属（Bacteroidetes,Sutterella和Oscillospira）在治疗后的患者中增加；虽然治疗后Veillonella在患者肠道内并未降低，但其相对丰度在疗效欠佳的患者中显著高于疗效好的患者。解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌PBC患者菌群功能改变PBC富集的通路：细菌侵入上皮细胞，过氧化物酶增殖激活受体信号通路和己内酰胺退化；健康人富集的通路：参与新陈代谢、氨基酸生物合成（如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）以及ɑ亚麻油酸新陈代谢的蛋白过表达。16S功能预测分析解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金牌案例分析内容解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌DOI:

10.1128/mBio.01926-14IF：6.956龈下微生物组的动态变化及其用于牙周炎诊断和预后的潜能样本类型：龈下牙菌斑(n=48)组学技术：宏基因组测序量：42.3million

reads/样本文献案例-牙周炎解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌龈下微生物组成及动态变化DOI:

10.1128/mBio.01926-14共检测出38个丰度大于1%的属。其中，Prevotella和Fusobacterium丰度最高；治疗前后β多样性有显著变化（ANOSIM分析显示p<0.001）；解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌龈下微生物组成及动态变化疾病状态下，大部分是厌氧菌， 而治愈状态下，大部分是兼性厌 氧或者好氧菌，8种菌在疾病状 态下的丰度较高，包括卟啉单胞 菌（Porphyromonas）、密螺 旋体属（Treponema）和坦纳 菌属（Tannerella）；治愈情况下有一些丰度高的菌， 说明疾病是由一组病原菌导致的，而不是单个的菌；DOI:

10.1128/mBio.01926-14解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成

长知识金牌龈下微生物中与牙周炎相关的微生物的共存关系疾病状态下菌群共存强度要显著大于治愈状态，表明早期微生物之间的协同和晚期的定 植促进疾病发生。治愈后，改变了这些菌群间的关系；健康相关菌的丰度有所增加，疾病相关微生物（红色和橘色）和健康相关微生物（黄色、绿色和紫色）之间并无相关性，证明这两组微生物之间存在对立关系；DOI:

10.1128/mBio.01926-14解

螺

旋

| 陪

伴

医

生

科

研

成长知识金牌牙周炎相关的功能通路疾病状态下，与鞭毛装配、细菌趋 药性（牙周炎的毒力因子）相关的 基因丰度较高。趋药性的运动能力 提高了病原菌对营养的摄取能力， 帮助了病原菌的定植，进而利于渗 透进入口腔上皮细胞；疾病相关菌的降解过程要多于合成 过程。说明龈下微生物可随着功能 来改变丰度，进而适应宿主的环境 的变化。DOI:

10.1128/mBio.01926-14解螺旋|陪伴医生科研成长知识金牌解

螺

旋

|陪伴医生科研成长知识金牌疾病相关菌微生物相关疾病Bacteroidaceae

sp.痛风Bacteroides痛风、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、糖尿病Clostridium（梭菌）T2D、痛风Porphyromonadaceae（紫单胞菌科）肠道中机会致病菌（痛风、强直性脊柱炎、克罗恩病）Rhodococcus（红球菌属）痛风、克罗恩病、系统性红斑狼疮（SLE）Erysipelatoclostridium肠道中机会致病菌（痛风）Anaerolineaceae（厌氧绳菌科）肠道中机会致病菌（痛风）Prevotella（普氏菌）来源于口腔和阴道牙周疾病、类风湿性关节炎Klebsiella（克雷伯氏菌）口腔致病菌、高血压Porphyromonas（卟啉单胞菌属）口腔致病菌、结直肠癌Faecalibacterium（粪杆菌属）肠道有益菌Lactobacillus（乳杆菌）肝硬化Roseburia（罗氏菌）肠道有益菌Bifidobacterium（双歧杆菌）肠道有益菌propionibacterium

acnes（丙酸痤疮杆菌）痤疮Fusobacterium（梭杆菌）肝硬化、结直肠癌、溃疡性结肠炎、高血压期刊名称影响因子研究方向Nature

Biotechnology41.667生物工程与应用微生物Nature

MicrobiologyNA微生物学Nature40.137综合性期刊Science37.205综合性期刊Nature

Reviews

Microbiology26.819微生物学Cell

Host

&

Microbe14.946微生物学FEMS

microbiology

reviews12.198微生物学Nature

Communications12.124综合性期刊Trends

in

Biotechnology11.126生物工程与应用微生物Trends

in

Microbiology11.02微生物学Nucleic

Acids

Research10.162生化与分子生物学Nature

Protocols10.032生化研究方法The

ISME

Journal9.664微生物学PNAS9.661综合性期刊Annual

Review

of

Microbiology9.415微生物学Microbiome8.496微生物学Water

Research6.942环境科学与工程学mBio6.956微生物学Current

opinion

in

microbiology6.635微生物学Global

environmental

change6.327环境科学Environmental

science

&

technology6.198环境科学与工程学Bioresource

Technology5.651生物工程与应用微生物Environmental

Microbio