粒细胞集落刺激因子在妊娠中的调节机制及其在不明原因复发性流产治疗中的研究进展

摘要不明原因复发性流产（unexplainedrecurrentspontaneousabortion，URSA）是妇科常见病及疑难病，其发病率呈逐年上升趋势。母-胎界面免疫耐受失衡是其重要原因之一。近年来的研究表明，粒细胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF）是一种参与调控母-胎界面免疫功能的细胞因子，在胚胎着床、胎盘及胎儿发育过程中发挥重要作用。本文就G-CSF在正常妊娠过程中的作用机制及其在URSA治疗中应用的研究进展做一综述，以期为URSA病理机制和临床干预技术的进一步研究提供参考。【关键词】粒细胞集落刺激因子；不明原因复发性流产；免疫耐受

复发性流产（recurrentspontaneousabortion，RSA）是指与同一性伴侣在妊娠20周内发生2次或2次以上的妊娠丢失，其发病率为1%~5%，且有逐年上升的趋势［1］。RSA的病因复杂，已明确的病因包括染色体、生殖解剖结构、内分泌功能的异常、血栓因素、自身免疫性疾病及生殖道的感染，还有近50%的RSA患者找不到确切的病因，称为不明原因复发性流产（unexplainedrecurrentspontaneousabortion，URSA）［2］。有研究表明，URSA与母-胎界面免疫耐受失衡有关［3］。因此，临床上也相继推出多种免疫治疗方案，包括T淋巴细胞免疫、静脉注射免疫球蛋白、环孢素等，均旨在修复妊娠期间特殊的母-胎界面免疫微稳态。近年来的研究表明，粒细胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF）在女性生殖过程中起重要调节作用，参与维持母-胎界面免疫平衡，为妊娠相关疾病的治疗提供了新靶点［4］。本文就G-CSF在正常妊娠母-胎界面调节作用机制及其在URSA等疾病治疗中应用的研究进展情况综述如下。一.G-CSF的概述1.G-CSF的来源及分布：G-CSF属于集落刺激因子家族，又称集落刺激因子3（colonystimulatingfactor3，CSF3）是一种糖基化的多肽链细胞生长因子。G-CSF来源很广泛，可由造血干细胞中的单核巨噬细胞系合成和分泌，也可由非造血细胞（成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、基质细胞和骨髓细胞）产生［5］，甚至某些恶性肿瘤细胞中也有G-CSF的表达［6］。G-CSF家族还包括巨噬细胞集落刺激因子（macrophagecolony-stimulatingfactor，M-CSF；colonystimulatingfactor1，CSF1）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF；colonystimulatingfactor2，CSF2），而M-CSF和GM-CSF在多种哺乳动物妊娠早期的输卵管和子宫中均有表达。此外G-CSF及其受体在人类输卵管上皮细胞以及母-胎界面蜕膜基质细胞和蜕膜巨噬细胞中均有表达［7］。G-CSF广泛分布于人体组织和血液循环中。在正常生理状态下，人外周血清中G-CSF含量较低，当人体处于感染或应激等异常状态时，其血清浓度会显著升高［8］。2.G-CSF的生物学特点：G-CSF蛋白由174个氨基酸组成，相对分子质量为18800，由位于17号染色体的q21-22区的单基因编码，全基因长度约2.3kb，含有5个外显子和4个内含子。G-CSF与特异性受体结合后，才能发挥其生物学作用。人G-CSF受体是一种跨膜蛋白，由813个氨基酸构成，相对分子质量为130000~150000。由于G-CSFRmRNA存在不同的剪接方式，有不同的翻译产物，因而存在5种不同的异构体［8］。G-CSF与G-CSFR结合后可形成四联复合体，特异性调节粒系祖细胞产生中性粒细胞，刺激骨髓中性粒细胞的增殖和分化，并将骨髓中的造血干细胞动员至外周血中，还可调节血管内皮细胞的分泌以促进血管的形成［9］。G-CSF还可通过与G-CSFR的结合激活多种信号转导通路，其中，JAK2-STAT3是G-CSF重要的下游信号通路，JAK2-STAT3信号通路可诱导抗凋亡蛋白产生，减少细胞凋亡［10］。二.G-CSF在正常妊娠过程中的作用1.G-CSF对子宫内膜容受性的调节作用（1）G-CSF调节子宫内膜蜕膜化：妊娠是一个复杂的生理过程，起始于受精卵与子宫腔上皮细胞和间质细胞的直接接触，即胚胎着床。为了更好地适应胚胎着床，子宫内膜基质细胞（endometrialstromalcells，ESCs）增殖分化为肥大、圆形、富含细胞质且多核的蜕膜基质细胞（decidualstromalcells，DSCs），此过程被定义为“蜕膜化”，受类固醇激素和多种细胞因子的调控。环磷酸酰胺（cyclicadenosinemonophosphate，cAMP）作为细胞内信号转导的第二信使，对激素诱导的蜕膜化至关重要，能显著促进ESCs中催乳素（prolactin，PRL）的合成和分泌［11］。早有研究表明G-CSF可通过自分泌或旁分泌的方式促进cAMP介导的ESCs蜕膜化［12］。近年有研究表明血清G-CSF水平在促性腺激素刺激卵巢自发排卵或诱导排卵时可达到高峰，且颗粒细胞产生的卵泡内G-CSF及其在卵泡液中的浓度均高于血清，提示G-CSF在卵泡环境中起旁分泌作用［13］。Tournaye等［14］通过酶联免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）法测定278名体外受精妇女卵泡液中G-CSF浓度，证明了卵泡液G-CSF浓度与相应胚胎的植入潜能有相关性，来自高G-CSF水平卵泡的胚胎，成功植入的概率比来自低G-CSF水平卵泡的胚胎高3.3倍。这两项研究更佐证了排卵后卵泡液G-CSF可通过旁分泌方式调节ESCs蜕膜化，从而改善子宫内膜容受性，以利于胚胎植入。除此之外，正常妊娠妇女的子宫内膜基质细胞也可分泌G-CSF，高明霞等［15］通过对子宫内膜容受性欠佳的患者宫内灌注G-CSF的研究表明，G-CSF可通过促进白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor，LIF）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）等细胞因子的表达来调节ESCs蜕膜化。Rezaee等［16］通过PCR检测结果表明在小鼠胚胎植入前转染含有G-CSF同家族重组GM-CSF的外周血单核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）可提高LIF、VEGF、基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的mRNA表达水平，从而改善子宫内膜容受性。（2）G-CSF调节子宫内膜增殖与修复：子宫内膜厚度也是预测子宫内膜容受性的指标参数之一，当排卵期子宫内膜厚度低于7mm时，妊娠成功的可能性极低［17］。近年Lian等［18］通过对271例薄型子宫内膜（≤7 mm）的冻融胚胎移植（frozen-thawedembryotransfer，FET）患者进行回顾性队列研究，证明了宫内灌注G-CSF的患者子宫内膜厚度明显增加（P<0.001）。在G-CSF对子宫内膜增殖的作用机制研究方面，孙亚喃［19］通过对体外培养的人子宫内膜细胞中加入不同浓度的G-CSF，研究得出G-CSF对子宫内膜增殖的作用是通过促进子宫上皮细胞和基质细胞中PCNA基因和SLP基因表达、调高Wnt信号通路上β-catenin蛋白的表达实现的。在动物研究方面，Liu等［20］采用20μL90%的乙醇宫内灌注建立薄型子宫内膜小鼠模型，观察了G-CSF同家族的GM-CSF对子宫内膜修复的影响。结果表明腹腔注射GM-CSF可明显增加子宫内膜厚度、子宫内膜腺细胞Ki67的表达及着床部位数目，并显著促进人子宫内膜腺细胞的增殖和基质细胞的迁移，且GM-CSF对子宫内膜的修复作用是通过激活PI3K/Akt信号通路介导的。（3）G-CSF通过动员骨髓干细胞调节子宫内膜容受性：手术、感染等因素损伤子宫内膜致使组织再生障碍或宫腔粘连是降低子宫内膜容受性的重要原因。间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）具有成体干细胞的自我更新能力和多向分化潜能，可介导组织修复与再生［21］。研究表明人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUMSC）移植可通过调节Th1/Th2细胞因子平衡和子宫内膜uNK细胞表达改善卵巢早衰（prematureovarianfailure，POF）小鼠的子宫内膜容受性［22］。曾有研究表明G-CSF可增加骨髓中间充质干细胞和造血干细胞的数量［23］。近年的研究基于基因芯片的转录分析表明G-CSF可激活与透明质酸代谢相关的多种信号通路，动员脂肪来源的骨髓间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells，BMSC），对ADSCs的治疗能力起直接的调节作用［24］。2.G-CSF对母-胎界面血管重铸的调节作用（1）G-CSF通过激活滋养层细胞相关信号通路调节血管重铸：妊娠期间胎盘血流量会大幅度增加，为保证胎盘有充足的血液灌注，满足胎儿的生长发育需要，母-胎界面子宫螺旋动脉会重铸为薄壁、低阻力、高通量的血管。近年的研究发现，G-CSF能有效降低妊娠早期RSA患者的子宫动脉阻力，通过改善子宫动脉高阻力促进母-胎界面的血管重铸［25］。血管重铸由绒毛外滋养层细胞（extravilloustrophoblastcells，EVTs）迁移到母体子宫蜕膜，并侵入到肌层的螺旋动脉壁内启动，EVTs侵入母体子宫肌层的过程类似于肿瘤细胞的迁移与侵袭，但不同的是，虽然EVTs的侵袭活性并不弱于肿瘤细胞，但在正常妊娠过程中，其侵入深度都能限制在子宫肌层的外1/3，过度侵入则会发生胎盘植入，而侵入不足则会导致着床失败而流产，说明EVTs的侵入过程受到精细调控。文献报道，G-CSF可通过激活以下信号转导通路调节滋养细胞的增殖和侵袭活性［26］。PI3k/Akt信号通路属于酪蛋白激酶受体型转导通路，是滋养层细胞正常迁移与浸润的一条关键通路，在HTR8/SVneo细胞中可以通过抑制PI3K/Akt信号通路从而抑制细胞的迁移和浸润［27］。研究表明G-CSF可通过激活PI3K/Akt信号通路增加人滋养层细胞系细胞中MMP-2和VEGF的表达与分泌，MMP-2能降解子宫基底膜的胶原结构、VEGF可促进胎盘血管的形成，从而增强人滋养细胞的侵袭能力［26］。另有研究表明，G-CSF可通过增强PI3K/AKT信号通路活性促进Bcl-2和VEGF的表达，减少细胞凋亡，增加血管内皮细胞的管腔容量［28］。MAPK通路中丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPKs）属于保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，MAPKs有4条主要的分支路线：ErK、JNK、p38MAPK和ERK5。通过抑制p38MAPK信号通路可以抑制HTR8/SV-neo的迁移［29］。PI3K是Erk1/2和p38MAPK的上游调节因子，G-CSF可通过激活PI3K介导的磷酸化作用而活化滋养层细胞Erk1/2MAPK信号通路［26］，也可作用于p38MAPK信号通路促进整合素β1的表达［30］。整合素是一种跨膜的α/β异二聚体，在细胞外基质和细胞内肌动蛋白骨架之间起双向联络作用，控制细胞骨架重塑，以及细胞的增殖、分化和迁移等。G-CSF还可通过促进细胞运动并诱导肌动蛋白骨架变化来调控滋养层细胞的迁移，其能诱导体外培养的滋养层细胞出现伪足生长、细胞体收缩、细胞尾端和周围基质黏着解离等迁移表型的转变［30］，而抑制G-CSF的表达能有效抑制妊娠早期滋养层细胞的侵袭［31］。（2）G-CSF通过抗氧化应激作用调节血管重铸：胎盘的发育可分为血管生成期和血管重铸期两个阶段，在血管生成期，血管内滋养细胞（endovasculartrophoblast，enEVT）逆行聚集成“栓子”，阻塞子宫螺旋动脉，造成生理性低氧状态。而在血管重铸期，enEVT栓溶解，绒毛间隙的血流量增加，平均氧分压上升，相当于慢性间歇性低氧复氧，过程类似于缺血再灌注损伤，导致活性氧簇生成，抗氧化物质被消耗而发生氧化应激。过度的氧化应激会导致滋养细胞老化凋亡，侵入过浅而影响血管重铸。曾有研究为评价G-CSF对卵巢缺血再灌注损伤的影响，对48只成年雌性SD大鼠进行随机对照实验，对卵巢组织进行病理学测定的结果表明，与对照组相比，G-CSF可显著降低总氧化状态（totaloxidationstate，TOS）和氧化应激指数（oxidativestressindex，OSI）的平均水平，从而预防大鼠卵巢缺血再灌注损伤［32］。在之后的研究中，Chen等［33］将hUMSC和G-CSF共同移植到肝损伤大鼠模型体内，采用ELISA法检测，结果表明hUMSC和G-CSF联合治疗可抑制氧化应激、促炎细胞因子的产生和肝细胞凋亡来改善肝功能衰竭（liverfailure，LF）。近年的研究表明G-CSF可抑制肾小管细胞凋亡，并通过增加髓系抑制细胞（myeloidderivedsuppressorcells，MDSCs）数量，减轻肾缺血再灌注损伤后的急性肾损伤和慢性肾纤维化［34］。子痫前期的发病机制也与缺血再灌注损伤后导致炎症反应和氧化应激影响血管重铸有关，有研究表明，与正常妊娠相比，子痫前期患者血清中G-CSF的表达下调，证实G-CSF抗氧化应激和抑制促炎细胞因子产生的作用参与调节母-胎界面的血管重铸［35］。3.G-CSF对母-胎界面免疫细胞功能的调节作用：妊娠对于母体来说是一个半同种异体移植的过程，胎儿携有遗传自父系的HLA抗原，而未引发母体对胎儿的排斥有赖于母体免疫系统对胚胎抗原的免疫耐受。蜕膜免疫细胞是母-胎免疫耐受机制的基础，主要包括蜕膜自然杀伤细胞（decidualnaturalkillercell，dNK）、T淋巴细胞、巨噬细胞等。（1）G-CSF对NK细胞的调节作用：NK细胞包括外周血NK细胞（peripheralbloodnaturalkillercells，pNK）和dNK，研究表明RSA患者血清中存在较高的NK细胞水平，pNK细胞数量增多、细胞毒性增强是导致RSA的危险因素［36］。近年一项回顾性研究的血清学检测指标表明G-CSF可降低pNK细胞的百分比［25］。另有研究表明G-CSF可显著降低外周血中干扰素-γ（IFN-γ）分泌型NK细胞1（naturalkiller1，NK1）的数量［37］。与pNK细胞不同，妊娠早期，dNK细胞数量会迅速增加，约占淋巴细胞总量的70%，研究表明dNK可通过分泌G-CSF、GM-CSF等细胞因子来调节滋养层的侵袭和螺旋动脉的重塑［38］。G-CSF还可通过募集dNK细胞诱导母-胎免疫耐受，并调节dNK细胞的细胞毒性，减少INF-γ和IL-18等细胞因子的产生［39］。（2）G-CSF对T淋巴细胞的调节作用：T淋巴细胞主要包括辅助性T（Thelper，Th）淋巴细胞和调节性T（regulatoryT，Treg）淋巴细胞，母-胎免疫耐受的机制为Th1/Th2平衡向Th2偏移、Th17/Treg平衡向Treg偏移。研究表明G-CSF可使有RSA病史的早孕妇女血清中CD3+T淋巴细胞增加、CD3+CD4+Th淋巴细胞百分比增加，可使Th1/Th2平衡向Th2偏移，另外可以活化幼稚CD4+T淋巴细胞，同时使CD4+效应记忆和终末分化的效应T细胞中CD3+T细胞和CD8+T细胞的百分比显著上调［25］。Scarpellini等［4］通过免疫组织化学法，与正常妊娠和未经G-CSF治疗的URSA流产患者进行比较，评估了G-CSF对URSA患者蜕膜的治疗效果，G-CSF治疗增加了蜕膜中表达Foxp3的细胞浓度，Foxp3是Treg细胞的特异性标记，而在未经治疗的URSA患者蜕膜中，这些细胞减少。表明G-CSF可诱导Treg细胞的发育，并动员骨髓中的Treg细胞转移到蜕膜。G-CSF还可抑制IL-2对人体蜕膜淋巴细胞的溶解作用［39］。另有研究为探讨G-CSF动员的异基因外周血干细胞移植（allogeneicperipheralbloodstemcelltransplantation，allo-PBSCT）急性移植物抗宿主病（acutegraftversushostdisease，aGVHD）发生率较低的具体机制，检测G-CSF治疗前后供体外周血γδTreg亚群的表达，结果表明G-CSF治疗后外周血中Vδ1Tregs、CD27+Vδ1Tregs和CD25+Vδ1Tregs的比例显著增加［40］。G-CSF是通过对T细胞的免疫调节作用使aGVHD发生率降低的。（3）G-CSF对巨噬细胞的调节作用：蜕膜巨噬细胞（dMΦs）是重要的抗原呈递细胞，能够维持免疫耐受和免疫应答之间的平衡。其分为两种表型M1和M2，M1表型具有促炎作用，M2表型可发挥免疫抑制作用。为促进对胎儿的免疫耐受，母-胎界面应以M2表型dMΦs为主。Seledtsov等［41］研究了G-CSF对MΦs表型的直接影响。结果表明G-CSF可抑制MΦs向M1表型的极化，有利于M2表型极化，并可下调MΦs中IFN-γ受体的表达和刺激IL-6的产生。另有研究表明G-CSF同家族的M-CSF可将dMΦs诱导分化为M2表型［42］。三.G-CSF在URSA和复发性种植失败（recurrentimplantationfailure，RIF）临床治疗中的应用现状Scarpellini等［43］2009年首次报道应用重组人G-CSF（recombinanthumanG-CSF，rhG-CSF）治疗URSA的一项随机对照试验，共纳入了68名URSA患者，将患者随机分为两组，对于治疗组在排卵后第6日起开始皮下注射rhG-CSF（n=35）（1μg·kg-1·d-1）治疗，直到月经来潮或妊娠9周，对照组则在相同的时间应用安慰剂（生理盐水）（n=33）进行治疗。最后以分娩健康婴儿的妊娠结局为主要的结局衡量标准。结果显示治疗组的35名女性中有29名（82.8%）产下健康婴儿，而对照组中仅有16名（48.5%）（P=0.0061），且应用rhG-CSF治疗的孕妇在妊娠期间的β-hCG水平明显高于对照组（P<0.001）。临床中rhG-CSF的给药方式除了皮下注射，还有宫腔内灌注的方式。Davari-tanha等［44］对100名RIF患者进行了随机双盲安慰剂对照试验。在卵母细胞穿刺当天或孕酮给药的FET周期宫内注射300μgrhG-CSF，相同时间注射生理盐水及安慰剂，共分rhG-CSF组40例、生理盐水组40例、安慰剂组20例，结果显示rhG-CSF可提高化学妊娠率和植入率。以上两项临床研究在排卵日或后6d开始给药，而Eapen等［45］对150名URSA患者进行了一项为期近两年的双盲安慰剂随机对照试验，分为rhG-CSF组76例、安慰剂组74例。从妊娠3~5周开始每日皮下注射130μgrhG-CSF或相同的安慰剂，最多持续到9周。结果显示与安慰剂组相比，rhG-CSF没有提高临床妊娠率。作者认为这个结果可能与纳入组别时，对RSA患者未进行排除其他明确非免疫病因致病者有关。Kamath等［46］对2019年2月以前15项比较G-CSF给药与不给药或安慰剂对接受IVF治疗妇女疗效影响的随机对照试验进行meta分析，共包括622名接受