高二 人教版 生物学选择性必修3 第3章《基因工程的基本操作程序(第2课时)》课件

广州市协和中学

李丽基因工程的基本操作程序(第2课时)高二—人教版—生物学选择性必修3—第3章基础知识回顾一.转基因抗虫棉的基本操作流程图3.将目的基因导入受体细胞将含有Bt基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定Bt基因是否稳定维持和表达其遗传特性1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建

用限制酶切割

载体和含有Bt基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体4.目的基因的检测与鉴定获取质粒、噬菌体等载体筛选和获取Bt基因请根据资料，参考转基因抗虫棉获取的主要步骤，设计获取转基因抗冻番茄的方案。探究·实践资料1：番茄是基础生物学研究中的重要对象和模式植物。但番茄不耐

寒，生长最适地温为20～23℃，当地温降到6℃时，根系停止生长。资料2：栖息于南极和北极的极地鱼类能长期在零下低温环境中生存，

也称为抗冻鱼。经研究发现，抗冻鱼血液中有抗冻蛋白afp，对冰

晶具有较高的亲和力，能够附着到冰晶表面，阻止冰晶长大，因此，

抗冻鱼能够在低于血浆冰点的温度下生存，而血浆不凝固，达到抗

冻效果。目前，科学家不仅掌握了抗冻蛋白基因afp的序列信息，

也对抗冻蛋白afp有了较为深入的了解。一.目的基因的筛选与获取1.从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。2.利用PCR扩增抗冻蛋白基因afp（3）原理：DNA半保留复制。转基因抗冻番茄（1）发明人：1985年，穆里斯等人，为此，1993年穆里斯获得诺贝尔化

学奖（我国台湾科学家钱嘉韵也作出了重要贡献）。（2）概念：PCR全称聚合酶链式反应，是在体外提供参与DNA复制的各种

组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。从基因文库中获取、人工合成、利用PCR获取目的基因：抗冻蛋白基因afp1.从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。2.利用PCR扩增抗冻蛋白基因afp转基因抗冻番茄参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链提供DNA复制的模板DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物合成DNA子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3＇端开始连接脱氧核苷酸表3-1DNA复制所需的基本条件（体外用高温代替）（体外耐高温）一.目的基因的筛选与获取1.从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。2.利用PCR扩增抗冻蛋白基因afp转基因抗冻番茄（4）条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶。一.目的基因的筛选与获取（5）扩增过程：（5）扩增过程：第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第四轮循环的产物。受热变性引物

耐高温的

DNA聚合酶(5)PCR扩增过程小结：1.从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。2.利用PCR扩增抗冻蛋白基因afp转基因抗冻番茄（6）结果：1个模板DNA分子经过n轮PCR，以

方式扩增，可以扩增出

个DNA片段。指数2n一.目的基因的筛选与获取1.从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。2.利用PCR扩增抗冻蛋白基因afp转基因抗冻番茄PCR扩增仪琼脂糖凝胶电泳一.目的基因的筛选与获取利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（）

A.PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶

B.变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶

C.复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则

D.延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸D二.基因表达载体的构建转基因抗冻番茄核心限制酶切割位点：插入需要转入的目的基因复制原点：DNA分子复制起始的地方标记基因：鉴定和筛选含有目的基因的

受体细胞启动子：DNA片段，RNA聚合酶识别和结合的

部位，驱动转录终止子：DNA片段，终止转录基因表达载体中启动子、终止子的来源：①如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。②如果目的基因是通过人工方法合成的，或是cDNA，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。二.基因表达载体的构建转基因抗冻番茄核心基因表达载体构建模式图质粒DNA分子（含抗冻蛋白基因afp）带有切口的质粒目的基因片段DNA连接酶含抗冻蛋白基因afp的重组质粒（同种或产生相同末端的限制酶处理）三.将目的基因导入受体细胞转基因抗冻番茄花粉管通道法农杆菌转化法转化：指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和

表达的过程。农杆菌在自然条件下能感染双子叶植物和裸子植物，一般不能感染单子叶植物。其细胞内含有Ti质粒，侵染植物细胞时，Ti质粒的T-DNA可转移至被侵染的细胞，并将其整合到该细胞的染色体DNA上。Ti质粒T-DNA目的基因构建表达载体含有目的基因的重组Ti质粒农杆菌转化法示意图：

转入农杆菌

导入植物细胞将目的基因插入染色体DNA中植物细胞表现新性状的植株两次导入细胞两次拼接含有重组Ti质粒的农杆菌三.将目的基因表导入受体细胞转基因抗冻番茄农杆菌转化法Ti质粒抗冻蛋白基因afp构建含抗冻蛋白基因afp的重组Ti质粒导入普通番茄细胞插入番茄细胞染色DNA上表达转基因抗冻番茄转入农杆菌思考：受体细胞选择体细胞还是受精卵？三.将目的基因导入受体细胞转基因抗冻番茄Ca2+处理（使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态）原核生物(常用)花粉管通道法动物显微注射法体细胞或受精卵受精卵农杆菌转化法生物种类导入方法受体细胞

植物大肠杆菌

最为广泛在基因工程中，为将目的基因导入受体细胞常采用农杆菌转化法，在农杆菌中常含有一个Ti质粒。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是（

）（单选）A．Ti质粒含有对宿主细胞生存具有决定性作用的基因，是基因工程中重要的载体。B．用Ca2＋处理细菌是重组Ti质粒导入农杆菌中的重要方法。C．土壤农杆菌成功感染植物细胞，可通过植物组织培养技术将该细胞培养成具有抗虫性状的植物。D．若能够在植物细胞中检测到抗虫基因，则说明将重组质粒成功地导入到了受体细胞。A四.目的基因检测与鉴定转基因抗冻番茄分子水平检测个体生物学水平鉴定利用PCR技术检测是否插入抗冻蛋白基因afp利用PCR技术检测是否转录出mRNA利用抗原-抗体杂交技术检测是否产生抗冻蛋白afp栽种在寒冷环境中下列技术依据碱基互补配对原理的是（

）（单选）①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因；

②检测目的基因是否转录出了mRNA；

③检测目的基因是否翻译成蛋白质；

④通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性。A．①②③④B．①②C．①②④D．①②③B转基因抗冻番茄的基本操作流程图3.将目的基因导入受体细胞

将含有抗冻

蛋白基因afp的

Ti质粒重新导入农杆菌，再把含有重组质

粒的农杆菌导入普通番茄细胞在分子水平

和个体生物学水平检测和鉴定抗冻蛋白基因afp是否稳定维持和表达其遗传特性1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建

用限制酶切割

Ti载体和含有抗冻蛋白基因afp的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体4.目的基因的检测与鉴定获取农杆菌Ti质粒筛选和获取抗冻蛋白基因afp目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。前提核心关键保证小结谢谢观看！广州市协和中学

李丽基因工程的基本操作程序(第2课时答疑)高二—人教版—生物学选择性必修3—第3章1.

PCR反应为什么需要2种引物？思考引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3‘端开始连接脱氧核苷酸。5＇目的基因3＇3＇5＇5＇3＇3＇5＇引物1引物22.PCR复性的过程一定是引物与DNA模板链结合吗？思考

复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰

撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。3.用PCR可以扩增mRNA吗？思考mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录为cDNA再进行扩增。单链RNA逆转录酶杂交双链RNA链DNA链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA（RNaseH）由mRNA逆转录为cDNA的过程示意图思考4.利用PCR获取目的基因时至少要经过几次循环才能分离出目的基因？至少要三次循环。第一次循环第二次循环第三次循环5.PCR技术中引物是什么？引物设计的依据是什么？如图所示的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，请分别说明理由。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物；细胞外（P