DB32T 3372-2018 东方百合脱毒技术规程

ICS65.020.20B05备案号：58108-2018DB32TechnicalTechnicalregulationofvirus-freefororientallily江苏省质量技术监督局IDB32/T3372—2018前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14脱毒设备（施）及化学试剂 15组培室消毒灭菌 16种源获取 17病毒检测 3DB32/T3372—2018本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由连云港市农业科学院提出并归口。本标准起草单位：连云港市农业科学院。本标准主要起草人：赵统利、孙明伟、邵小斌、朱朋波、汤雪燕、王江英。1DB32/T3372—2018东方百合脱毒技术规程本标准规定了东方百合脱毒技术的术语和定义、脱毒设备、组培室消毒灭菌、种源获取、病毒检测等技术要求。本标准适用于具备生物技术条件下的东方百合脱毒技术。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18247主要花卉产品等级第6部分：花卉种球NY/T1491花卉植物病毒检测规程NY/T2306花卉种苗组培快繁技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1东方百合orientallily由天香百合、鹿子百合、日本百合、红花百合等种与湖北百合的杂种中选育出来的栽培杂种系。4脱毒设备4.1组培场地建设组培实验室应选择安静、清洁、无污染的地方。4.2洗涤设备工厂化生产可选用自动洗瓶机，另外配置干燥箱、晾瓶架等。4.3百合脱除病毒设备超净工作台、培养箱、解剖刀、镊子、解剖针、解剖镜等。4.4灭菌设备高压蒸汽灭菌锅、器械消毒器、紫外灯、烘干箱、微滤孔器等。2DB32/T3372—20185组培室消毒灭菌按NY/T2306要求进行组培室消毒。6种源获取6.1鳞片诱导成鳞茎6.1.1鳞片选取选取完整、无病虫害无病斑且周径≥14cm的百合鳞茎，由外向内完整的剥取中层鳞片，流水冲洗净表面泥垢后,用0.2%～0.5%的洗衣粉水冲洗10min，在自来水流水条件下冲洗30min。6.1.2外植体获取用75%酒精灭菌30s，再用0.1%的升汞溶液浸泡8min～10min，期间不断进行摇动，使鳞片充分与溶液混合，最后用无菌水冲洗5次～6次。将鳞片外围1mm的部分切除，然后选取外层下部与鳞茎盘相连的部分为最佳外植体横切约为0.5cm厚的小块。6.1.3诱导与增殖愈伤组织6.1.3.1愈伤培养基配方MS+2mg/L6-BA+1mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。6.1.3.2鳞片接种将切好的百合鳞片，将底部切口平放于诱导愈伤培养基上，形成愈伤。6.1.4愈伤诱导成小鳞茎6.1.4.1培养基配方MS+0.5mg/L6-BA+15g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。6.1.4.2愈伤接种将鳞片上的愈伤取出并切成黄豆粒大小，平放于诱导愈伤培养基上。6.1.4.3培养条件愈伤及成鳞茎诱导均放置于培养室中，置于23℃~27℃,进行光照与黑暗比例为16h/8h条件下培养，光照强度为3000lx～5000lx。在培养期间，每隔20d更换一次培养基。6.2组培鳞茎增大培养6.2.1组培鳞茎增大培养基配方MS+1mg/LIBA+60g/L蔗糖+6.5g/L，pH为5.8～6.06.2.2小鳞茎接种将分化的小鳞茎接种到组培鳞茎增大培养基上培养。3DB32/T3372—20186.2.3培养条件将接种的鳞茎，置于23℃~27℃条件下，暗培养60d即可长成直径大于0.5cm以上的组培鳞茎。在培养期间，每隔20d更换一次培养基。6.3打破休眠把增大的组培鳞茎，整瓶转至4℃暗培养的冷藏室内，暗培养60d～80d解除休眠。6.4热处理将解除休眠的百合鳞茎，整瓶置于人工气候箱中每天升高1℃至变温培养（38℃-10h，26℃-14h）,暗培养持续15d～25d。6.5剥取茎尖培养成鳞茎6.5.1茎尖诱导愈伤培养基MS+2.5mg/LPicloram+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.06.5.2茎尖接种把热处理过的百合组培鳞茎，在10倍～80倍的解剖镜下，用解剖刀剥除外部鳞片漏出生长点，用解剖针挑取0.5mm～0.7mm大小的茎尖生长点接种到诱导愈伤培养基上。6.5.3培养条件将接种的茎尖至于25℃条件下，全暗培养60d～80d，每20d更换一次培养基。6.6愈伤诱导成球按6.1.4与6.2的步骤进行百合籽球的培养。7病毒检测将脱毒的百合组培鳞茎，采用多重RT-PCR法（引物序列见表1）进行主要病毒（黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、百合无症病毒（Lilysymptomlessvirus，LSV）和百合斑驳病毒（Lilymosettlevirus，LMoV）的检测，检测