DB32T 3367-2018 水稻细菌性条斑病监测与检测技术规程　

65.02065.020B16B16备案号：58103-2018DB32ICSICSTechnicalTechnicalspecificationformonitoringanddetectionforbacterialleafstreakofrice江苏省质量技术监督局IDB32/T3367—2018前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14监测与检测条件 14.1主要试剂 24.2用具及仪器 25监测技术 25.1监测范围 25.2监测方法 26检测技术 36.1样品处理 36.2检测方法 37结果判定和报告 37.1结果判定 47.2结果报告 48样品处理和样品、菌种保存 49疫情处治 4附录A（资料性附录）试剂及培养基的配制方法 5附录B（资料性附录）水稻细菌性条斑病基本信息 8附录C（资料性附录）Padlock探针结合斑点杂交检测程序 9附录D（资料性附录）水稻细菌性条斑病疫情监测记录表 附录E（规范性附录）植物有害生物样本鉴定报告 DB32/T3367—2018本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构及编写》给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准主要起草人：刘凤权、赵延存、徐会永、赵杨扬、龚伟荣、田子华。1DB32/T3367—2018水稻细菌性条斑病监测与检测技术规程本标准规定了水稻细菌性条斑病的监测与检测技术方法。本标准适用于水稻细菌性条斑病发生区及杂交水稻制种区。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2-1995农作物种子检验规程扦样GB8371-2009水稻种子产地检疫规程GB/T28078-2011水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法NY/T2287-2012水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1检疫性有害生物quarantinepest对受其威胁的地区具有潜在的经济重要性，但未在该地区发生，或虽已发生但分布不广并进行官方防治的有害生物。3.2疫区epidemicarea由官方划定已发现有检疫性有害生物危害并由官方控制的地区。3.3监测surveillance对某种疫病的发生、流行、分布及相关因素进行系统的长时间的调查与检测，以掌握该疫病的发生发展趋势。3.4检测test为确定是否存在有害生物或为鉴定有害生物种类而进行的，除目测以外的检查。4监测与检测条件2DB32/T3367—20184.1主要试剂磷酸氢二钠（Na2HPO4）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、碘化钾（KI）、碘（I2）、氯化钾（KCl）、氢氧化钠（NaOH）、碳酸氢二钠（Na2HCO3）、氯化钠（NaCl）、叠氮化钠（NaN3）、氯化镁（MgCl2）、七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、对硝基苯磷酸二钠（PNPP）、草酸铵[(NH4)2C2O4]、顺丁烯二酸（C4H4O4）、十二烷基硫酸钠（SDS）、柠檬酸三钠、吐温-20、Tris碱、Tris-HCl、硼酸、结晶紫、番红、EDTA、无水乙醇、琼脂糖、DIGDNALabelingKit(Roche)、市售抗体、市售酶标抗体、脱脂奶粉、PCR试剂。监测和检测过程中所需溶液及培养基配方，参见附录A。除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂。4.2用具及仪器采集夹、采集袋、标本夹、标本纸、剪刀、纸袋、放大镜、镊子、刀片、标签纸、超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、显微镜、低温冷冻高速离心机、酶标仪、电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、超纯水仪、移液器、GPS等。5监测技术5.1监测范围重点监测杂交水稻制种基地、病害发生区、水稻种子调运过程。5.2监测方法5.2.1种子监测5.2.1.1调运种子的监测对调运种子，特别是从疫情发生区调往非疫区的杂交水稻种子，查阅调运种子的品种、产地、发病史、检疫等信息，按照GB/T3543.2-1995中5的要求进行抽样，对疑似带菌种子进行室内检测。5.2.1.2市场销售种子的监测对市场销售种子，特别是疫区市场销售种子，查阅种子生产流通信息及品种发病历史等信息，观察种子的外观，按照GB/T3543.2-1995中5的要求进行抽样，将样品进行室内检测。5.2.2田间监测5.2.2.1杂交水稻制种基地田间监测秧田期踏查1次，拔节至抽穗期至少踏查2次，乳熟期踏查一次，特别是在台风暴雨前后要及时进行踏查。每个品种均要踏查，踏查面积占总面积的50%以上，踏查方法参照GB8371-2009中8.1的要求执行。调查过程中，发现具有水稻细菌性条斑病典型症状（见附录B），即可认定为水稻细菌性条斑病；对疑似症状的叶片，直接采样进行室内检验。5.2.2.2疫区田间监测根据种植地发病史和栽培品种发病史，选择有代表性的田块进行定期踏查。秧田期踏查1次，拔节至抽穗期至少踏查2次，特别是在台风暴雨前后要及时进行踏查。发现初始发病点后，要对该发明点附近田块和该区域（以县、区为单位）内感病品种进行普查。在调查过程中，发现具有水稻细菌性条斑病典型症状（见附录B），即可判定为水稻细菌性条斑病；对疑似症状的叶片，直接采样进行室内检验。3DB32/T3367—20185.2.2.3非疫区田间监测选择区域内具有代表性的杂交水稻田块，秧田期踏查1次，拔节至抽穗期踏查2次。在调查过程中，发现具有水稻细菌性条斑病疑似症状叶片（见附录B），直接采样进行室内检验。对疑似发病地点周边田块和该区域（以县、区为单位）内种植该品种田块进行踏查，踏查面积占总面积的30%以上。6检测技术6.1样品处理6.1.1种子样品处理水稻种子样品的处理参照GB/T28078-2011中8.1的要求执行。6.1.2叶片样品处理水稻叶片样品的处理参照GB/T28078-2011中8.2的要求执行。6.2检测方法6.2.1常规检测6.2.1.1菌溢检查切取田间采回的植株叶片病健交界处约20mm2，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低倍显微镜下观察并记录有无喷菌现象。6.2.1.2形态特征检测将样品提取液分别划线于NA和NBY培养基上，28℃培养2d～3d，参照附录B.3的标准执行。6.2.1.3革兰氏染色检测按照NY/T2287-2012中7.2.3的要求执行。6.2.1.4致病性测定参照GB/T28078-2011中12的要求执行。6.2.2Padlock探针结合斑点杂交检测水稻细菌性条斑病Padlock探针结合斑点杂交检测程序参见附录C。6.2.3PCR检测参照NY/T2287-2012中7.4的要求执行。6.2.4ELISA检测参照GB/T2287-2012中7.3的要求执行。如采用市售的试剂盒，按说明操作。7结果判定和报告4DB32/T3367—20187.1结果判定7.1.1症状识别判定田间植株发病症状符合附录B描述的水稻细菌性条斑病典型症状，判定为水稻细菌性条斑病。7.1.2常规检测结果判定镜检有菌溢现象，分离培养物形态特征和培养特性符合水稻细菌性条斑病菌的形态特征（参见附录B），革兰氏染色阴性，致病性测定产生典型症状，并再次从接种病斑成功分离病原菌，确定病原菌为水稻细菌性条斑病菌。7.1.3Padlock探针结合斑点杂交检测结果判定观察斑点杂交尼龙膜显色结果，阳性对照显色，且阴性对照不显色的前提下，待测样品显色，即可判定样品携带水稻细菌性条斑病菌；否则为阴性反应，即样品不携带水稻细菌性条斑病菌。7.1.4PCR检测结果判定观察电泳结果，阳性对照在338bp处有条带出现，且阴性对照无条带出现的前提下，待测样品在338bp处有条带出现，即可判定样品携带水稻细菌性条斑病菌；否则为阴性反应，即样品不携带水稻细菌性条斑病菌。7.1.5ELISA检测结果判定在阴性对照OD值≤0.1，且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下，样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时，判定为阳性反应，即样品携带水稻细菌性条斑病菌；否则判定为阴性反应，即样品不携带水稻细菌性条斑病菌。7.2结果报告7.2.1监测报告记录监测结果并填写《疫情监测记录表》（见附录D）。对监测结果进行整理汇总，形成监测报告。7.2.2鉴定报告将实验室检测鉴定结果填入《植物有害生物样本鉴定报告》（见附录E）。8样品处理和样品、菌种保存监测与检测过程中使用的有关材料和用具，在使用完毕后应进行消毒和除害处理。经检测鉴定后的种子样品应在4℃下保存三个月；保存期满后，进行灭活处理。分离鉴定的水稻细菌性条斑病菌利用25%甘油保存于-80℃。9疫情处治经监测或室内检测发现水稻细菌性条斑病，应指导生产、销售和个人实施检疫处治及病害防治。5DB32/T3367—2018（资料性附录）试剂及培养基的配制方法A.1革兰氏染色液A.1.1结晶紫液A液：结晶紫2g，95%乙醇20mL；B液：(NH4)2C2O40.8g，蒸馏水80mL。使用前将A、B液相混，静置48h后使用。A.1.2碘液21g，KI2g，蒸馏水300mL，将KI溶于少量蒸馏水中，然后加入I2，待I2全部溶解后，加水稀释至300mL。A.1.3番红花红液2.5%番红花红乙醇溶液10mL，蒸馏水100mL。A.2样品提取液取1.15gNa2HPO4、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、8gNaCl、0.2gNaN3，用1000mL蒸馏水溶解，并调整pH值到7.4。A.3Padlock探针结合斑点杂交检测A.3.1中和缓冲液取87.66gNaCl、78.8gTris-HCl，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，并调整pH值到7.2。A.3.2碱性转移液取16gNaOH、58.44gNaCl，用蒸馏水溶解并定容至1000mL。A.3.3MaleicacidBuffer取11.61g顺丁烯二酸、8.77gNaCl，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，并调整pH值到7.5。A.3.4DetectionBuffer取15.76gTris-HCl、5.84gNaCl，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，调整pH值到9.5，然后121℃湿热灭菌20min。A.3.520×SSC取175.32gNaCl、88.23g柠檬酸三钠，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，调整pH值到7.0，然后121℃湿热灭菌20min。6DB32/T3367—2018A.3.6预杂交液RocheDIG杂交试剂盒中的7号液。A.3.7杂交液标记探针按照25ng/mL终浓度加入到预杂交液（现配现用）。A.3.8洗脱液A取100mL20×SSC、5g十二烷基硫酸钠，用蒸馏水定容至1000mL（现配现用）。A.3.9洗脱液B取10mL20×SSC、5g十二烷基硫酸钠，用蒸馏水定容至1000mL（现配现用）。A.3.10WashingBuffer取11.61g顺丁烯二酸、8.77gNaCl、3mLTween-20，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，调整pH值到7.5（现配现用）。A.3.111×Blockingsolution用Maleicacidbuffer10倍稀释RocheDIG杂交试剂盒中的6号液（现配现用）。A.3.12Antibodysolution按1:5000比例用Blockingsolution稀释RocheDIG杂交试剂盒中的4号液（现配现用）。A.3.13Clor-substratesolution取RocheDIG杂交试剂盒中的5号液200μL，用DetectionBuffer补足至10mL（现配现用）。A.4PCRA.4.1PBS缓冲液在930mL蒸馏水中按次序慢慢加入1.15gNa2HPO4、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、8.0gNaCl、0.2gNaN3、调节pH至7.4，加蒸馏水定容至1000mL。A.4.2电泳缓冲液TBE在1000mL去离子水中加入Tris碱54g、硼酸27.5g、20mL0.5MEDTA（pH8.0），使用时利用去离子水10倍稀释，即为0.5×TBE。A.4.3琼脂糖凝胶在0.5×TBE工作液中加入1%(w/v)的琼脂糖，融化，冷却至60℃倒入插入梳子的制胶槽中，冷却凝固后点样电泳。A.4.4样品缓冲液取溴百里酚蓝0.025g，乙二醇3g，加10mL蒸馏水。7DB32/T3367—2018A.5ELISAA.5.1洗涤液取1.15gNa2HPO4、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、8gNaCl、0.5g吐温-20，用蒸馏水溶解并定容至1000mL，调整pH值到7.4。A.5.2封闭液取5g脱脂奶粉，用100mL样品提取液溶解。A.5.3包被液取2.93gNa2HCO3、1.59gNaCl、0.2gNaN3，用1000mL蒸馏水溶解，并调pH值到9.6。A.5.4抗体稀释液取2.5g脱脂奶粉、加100mL洗涤液溶解。A.5.5底物缓冲液用80mL灭菌蒸馏水将0.01gMgCl2、0.02gNaN3、9.7mLCH2CH2OH溶解后，调整pH值到9.8，用灭菌水定容至100mL。A.5.6底物溶液取5mgPNPP溶解于5mL底物缓冲液中。底物溶液制备需在孵育结束前10min制备，避光保存。A.5.7终止液取12gNaOH，用100mL蒸馏水溶解。A.6NBY培养基取牛肉浸膏8.0g，酵母提取物2.0g，K2HPO42.0g，KH2PO40.5g，葡萄糖2.5g，琼脂15g，加水定容至1000mL，121℃湿热灭菌20min，灭菌后加1mL过滤除菌的1MMgSO4·7H2O溶液。A.7NA培养基取聚蛋白胨5g，蔗糖10g，酵母提取物1g，牛肉浸膏3g,琼脂15g，加水定容至1000mL，调pH至7.0，121℃湿热灭菌20min。8于原核生物界(Procaryotae),薄壁菌门(Gracilicutes),假单胞菌科(Pseudomonadaceae),黄致病变种),在水稻(Oryzasativa)上引起细菌性条斑病(Bacterialleafstreak),属国内植物检疫性有害生物(B类)。9DB32/T3367—2018（资料性附录）Padlock探针结合斑点杂交检测程序C.1制样C.1.1种子样品取样品种子20g，首先用蒸馏水冲洗以去除残片和表面的污染杂菌；将清洗后的种子用小型粉碎机粉碎10s，使谷壳破裂，然后用25mL样品提取液4℃浸泡2h；将侵泡液10000r/min离心10min，弃上清，重复离心1次，沉淀用蒸馏水悬浮定容至1mL，作为待检测模板。C.1.2叶片样品将田间采回的植株叶片先用无菌水洗2次，再用75%乙醇表面消毒15s。将样品剪成20mm2小片，装入烧杯中，按照供试样品质量（g）:样品提取液体积（取10mL侵泡液10000rpm离心10min，弃上清，重复离心1次，沉淀用蒸馏水定容至1mL，作为检测模板。C.2探针的链接与外切酶处理C.2.1Padlock探针（田艳丽，2009）5’-CCACACAACACGGCATATCGCTCCAAGGCTCGACCGTTAGCAGCATGACCGAGATGTACCGCTATCGTGCGGCATACGTTCGTCAAATGGTGGCTTTGTACC-3’C.2.2探针的链接采用三种外切酶EcoRⅠ、HindⅢ和BamHⅠ消化待连接的DNA检测模板，连接采用10μL体系：1μL经内切酶消化的检测模板，1μLpadlock探针（100pm/μL），0.2μLTaqDNA连接酶（20U/μL），1μL鲑鱼精DNA（20ng/μL），6.8μL灭菌超纯水。连接反应程序为：95℃预变性5min；然后进入循环，95℃变性30s，65℃连接5min，共20个循环；然后95℃灭活15min。C.2.3链接产物的外切酶处理采用核酸外切酶切除自连和错连的探针：在连接后的产物中加入2个单位的核酸外切酶Ⅰ和2个单位的核酸外切酶Ⅲ,37℃反应2h，然后将反应后的产物95℃灭活3h。C.2.4探针的扩增采用经地高辛标记的通用引物P1-F（5’-CTCGACCGTTAGCAGCATGA-3’）和P2-R（5’-CCGAGATGTACCGCTATCGT-3’）对连接产物进行PCR扩增，25μL反应液体系：0.5μMP1-F和P2-R，4种dNTP各50μM，2.5μL10×PCR反应缓冲液，2mMMg2+，2.5μL1%BSA，1.25UTag酶（TaKaRa3μL经核酸外切酶处理后的连接产物，灭菌超纯水补足。反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸7min。反应结束后取5μL扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶、100V条件下电泳30min，在凝胶成像系统上检测并拍照。DB32/T3367—2018C.3斑点杂交检测C.3.1点样根据待检测样品量，剪取一块适合的尼龙膜，剪下一角作为标记；取4μL（50ng/μL）cZipCode探针（CGCCGTATGCAAGCAGTTTA）点到尼龙膜上，每一个样品设4个重复，以不能与padlock探针ZipCode序列互补的核酸序列作为阴性对照，以已知水稻细菌性条斑