DB32T 3358-2018 红花石蒜组培快繁技术规程

65.020.2065.020.20B05B05备案号：58094-2018DB32ICSICSTechnicalTechnicalregulationfortissuecultureofLycorisradiata江苏省质量技术监督局IDB32/T3358—2018本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准的附录A、附录B均为资料性附录。本标准由江苏省中国科学院植物研究所提出并归口。本标准起草单位：江苏省中国科学院植物研究所。本标准主要起草人：汪仁、江玉梅、贺佳、徐晟、李晓丹、李宜奎、夏冰、彭峰。1DB32/T3358—2018红花石蒜组培快繁技术规程本标准规定了红花石蒜（Lycorisradiata）外植体采集与处理、培养基配置、外植体接种、组织培养、炼苗移栽、移栽苗管理和记录等技术要求。本标准适用于红花石蒜组培苗的生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6001育苗技术规程LY/T1000容器育苗技术3外植体采集与处理3.1外植体采集3.1.1在3月~10月选择晴天的天气，采集表面无损的鳞茎作为外植体。3.1.2将红花石蒜周围约30cm的土壤挖开，用手刨出鳞茎球，拨掉球茎所带的泥土。采集完球茎后，覆土填平。3.2外植体处理3.3.1剪去红花石蒜鳞茎球根部，剥去外层鳞茎片，带鳞茎盘切成长为2cm~3cm的鳞茎片，放入烧杯中用1%洗衣粉溶液浸泡5min，然后流水冲洗1h~2h，最后用蒸馏水冲洗，转至超净工作台。3.3.2在超净工作台上，用配制好的75%乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗2次~3次。3.3.3配制终浓度为1%的次氯酸钠消毒液，用其浸泡材料30min后，用无菌水冲洗5次~6次，并用无菌滤纸吸干水分后备用。4培养基配制4.1MS培养基母液配制4.1.1制作培养基前需先配制培养基母液，MS培养基母液配制比例参见附录A。4.1.2母液配制应用蒸馏水。4.1.3配制大量元素母液时，每个组分单独溶解，避免沉淀发生。2DB32/T3358—20184.1.4配制后的母液应置于4℃冰箱中冷藏保存，微量元素母液用棕色瓶盛装保存，母液配制后应及时使用，贮存时间不宜超过3个月。4.1.5母液容器上应贴好标签，注明名称、配制日期，发现母液中有沉淀或絮状物出现应停止使用。4.2植物生长调节物质母液配制植物生长调节物质母液的配制浓度为0.5mg/mL，其配制方法参见附录B。母液配制好后滤膜过滤除菌，滤液贴好标签并置于4℃冰箱中冷藏，保存期不超过3个月。4.3培养基选择诱导培养基为：MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L；增殖培养基：MS+6-BA5.0mg/L+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L；生根培养基：MS+IBA1.0mg/L。4.4培养基制作4.4.1准备好配制容器（1L烧杯、玻璃棒和量筒）、蒸馏水、琼脂粉、蔗糖和各类母液等。4.4.2先用烧杯盛有少量蒸馏水，参考用量参见附表A。4.4.3按蔗糖浓度30g/L计算用量，称量后用蒸馏水溶解，然后用容量瓶定容。4.4.4根据培养基的选择加入植物生长调节物质，玻璃棒搅拌均匀。用pH计测试酸碱度，调节pH值至5.6~5.8。4.4.5将称量好的琼脂粉（6g/L~7g/L）加入烧杯中加热搅拌至完全溶解。4.4.6分装时，不应将培养基倾倒在培养瓶瓶口。分装后立即用瓶盖盖上，并旋紧。4.5培养基灭菌4.5.1将分装好的盛有培养基的培养瓶放入高压蒸汽灭菌锅内。打开冷凝阀，排尽灭菌锅内的冷空气。当气压达到0.1Mpa、温度升至121℃时开始计时，保持温度并进行压力灭菌20min。4.5.2关闭灭菌锅电源，以慢排方式排放热气。待灭菌锅内的气压表指针降至0时再打开高压灭菌锅盖，取出培养基。将培养基平放置于接种室或培养室内进行冷却。4.6培养基保存灭菌后的培养基应注明培养编号及配制日期，同时按培养基种类、配制先后顺序分别储存于接种室或培养室。储存时间不宜超过2周。5外植体接种5.1接种环境接种前，接种室和超净工作台内要进行紫外线消毒20min~30min，操作人员关闭紫外灯并通风15min后再进行操作。操作时应佩戴一次性乳胶手套，并在进入超净台前用75%乙醇喷洒消毒。接种结束后，应及时清理接种室和超净工作台及杂物。5.2接种3DB32/T3358—20185.2.1将接种工具（手术刀和镊子）用牛皮纸包好，放入高压蒸汽灭菌锅内，按照4.5的方法，进行高压灭菌。将灭菌好的接种工具放入65℃烘箱中干燥24h，喷洒75%的乙醇表面消毒后立即转移至超净工作台。每转接完一个培养瓶中的培养材料，均应将接种工具放在酒精灯外燃火焰上灼烧10s，同时更换接种器皿中的滤纸，以避免交叉污染。5.2.2在无菌的培养瓶中，将消毒处理后的鳞茎小块接种于诱导培养基上，每瓶接种1块~2块。接种完成后，用记号笔在培养瓶上标注接种日期、编号或名称。5.2.3每次接种完毕后，应用75%的乙醇将超净工作台的台面及两边挡板等擦拭干净，同时将接种器皿及接种工具重新按照5.2.1的方法进行灭菌消毒处理。6组织培养6.1培养条件培养室内温度为24±2℃,培养瓶上部的光照强度为100μmol-1m-2s-1~150μmol-1m-2s-1，光照时间为每6.2诱导培养将已消毒的鳞茎小块接种在诱导培养基上，15d~20d后芽开始萌发，25d左右茎尖变绿并伸长生长，40d左右芽可长高至2cm~3cm。6.3增殖培养将诱导培养形成的单个幼芽或丛生芽，接种到增殖培养基上进行培养。增殖培养周期约为30d。6.4生根培养将增殖培养后的丛生芽切割成单个完整的幼芽，并使其基部插入生根培养基中，进行生根培养2周~3周。~7炼苗移栽7.1炼苗选取株高大于3cm，根长1cm~4cm，且形成小鳞茎的组培苗放置温室自然散射光下，打开瓶盖，加注少量无菌水（水深0.5cm左右）炼苗2d~3d，控制温度在18℃~28℃,湿度控制在70%~80%。7.2移栽7.2.1移栽基质泥炭土与珍珠岩比例为2:1，并加入0.5g/L的多菌灵搅拌均匀，然后装入营养钵中压紧待用。7.2.2用镊子将无菌苗从培养瓶中小心取出，注意保护根系，将根部粘附的琼脂用30℃~35℃清水清洗干净，移到营养钵中，用基质将根埋好。移栽后及时浇透水，外面用遮阳网罩着，避免阳光直射。4DB32/T3358—20188移栽苗管理和记录8.1水分管理在遮荫且通风条件下培养2d~3d，向叶面喷水1次，2周后，撤掉遮荫，但要注意通风。此后，每隔2周~3周浇水1次。8.2大田移栽时间移栽苗移栽完成2个月以上于当年秋季或翌年春季移栽至大田。8.3记录应建立完整、真实的组培栽培管理记录档案，档案保存2年以上。5DB32/T3358—2018（资料性附录）MS培养基母液配制表表A.1MS培养基母液配制表NH4NO3MgSO4·7H2OKH2PO45H