生物学案：课堂互动DNA重组技术的基本工具

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精课堂互动三点剖析一、基因工程的原理基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术。基因工程具有以下五个方面的特点：①它是一种按照人们的意愿，定向改造生物遗传特性的技术；②在DNA分子水平上进行操作；③是在体外进行的人为的基因重组；④一旦成功，便可遗传；⑤主要技术为体外DNA重组技术和转基因技术。二、限制性内切酶-—“基因手术刀”限制性内切酶简称限制酶，主要存在于微生物中,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,在特定的核苷酸序列，在特定的切点上切割DNA分子（如下图）。例如,从大肠杆菌中发现的一种限制酶只能识别GAATTC序列，并在G和A之间将这段序列切开。目前已经发现了约4000种限制酶，它们的切点各不相同.苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因，就能被某种限制酶切割下来。三、DNA连接酶——“分子缝合针”限制酶切割DNA分子示意图从上图中可以看出，被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸,它们之间正好互补配对，这样的切口叫做黏性末端。可以设想，如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，然后让两者的黏性末端黏合起来，似乎就可以合成重组的DNA分子了。但是，实际上仅仅这样做是不够的,互补的碱基处虽然连接起来,两边的扶手的断口处还没有连接起来，如下图。要把扶手的断口处连接起来，也就是把两条DNA末端之间的缝隙“缝合"起来，还要靠另一种极其重要的工具，即DNA分子“缝合针”——DNA连接酶。根据DNA连接酶的来源不同，可以将这些酶分为两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的,称为E·coliDNA连接酶。E·coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。另一类是从T4噬菌体中分离出来的,称为T4DNA连接酶。T4DNA连接酶既可以“缝合"双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低。拓展延伸DNA连接酶是将双链DNA片段“缝合”起来，或者说将断成两截的梯子的“扶手"接起来，其实质是恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。而DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的DNA片段上。所以说，DNA连接酶和DNA聚合酶不是一回事，两者的催化作用不同。四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车"载体使用有两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。现在所用的运载体主要分两类：一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小，独立于拟核以外的一种小型环状DNA，有的细菌有一个，有的含多个。质粒可以通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌拟核中的大型DNA中，随染色体DNA复制而同步复制。另一类是病毒，包括植物病毒、动物病毒和细菌病毒（噬菌体），现在人们还在不断寻找新的运载体。作为运载体必须具备三个条件：①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制。②有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个,例如大肠杆菌PBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入。③有一定标记基因,便于进行筛选.如大肠杆菌的PBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。一般来说，天然载体往往不能满足上述要求，因此要根据不同的目的和需要，对载体进行人工改造,现在所使用的质粒几乎都是经过改造的。学以致用【例1】科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术-—基因工程，实施该工程的最终目的是（）A。定向提取生物体的DNAB.定向地对DNA分子进行人工剪切C。在生物体外对DNA分子进行改造D。定向地改造生物的遗传性状解析:基因工程是通过对生物体的基因进行修饰改造，使之按照人们的意愿表现出人们所需要的性状，产生出人类所需要的基因产物。可见，基因工程的目的是要定向地改造生物的遗传性状.答案：D【例2】在基因工程中用到的限制性核酸内切酶主要从原核生物中获得，一种限制酶只能识别双链DNA某种特定核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子,这与酶的什么性质相吻合（）A。高效性B。具有多样性C。专一性D.催化活性受外界条件影响解析:酶具有多种性质,其中专一性是指一种酶只能催化一种或一类化合物的化学反应。一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子,这显然和酶的专一性相吻合。答案：C【例3】下图为DNA分子的切割和连接过程。DNA分子的切割和连接（1）EcoRⅠ是一种_________酶，其识别序列是_________，切割位点是_________与_________之间的_________键。切割结果产生的DNA片段末端形式为_________.（2）不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是_________连接酶,此酶的作用是在_________与_________之间形成_________键，而起“缝合”作用的.还有一种连接平末端的连接酶是_________。解析:根据限制酶和DNA连接酶在基因工程中的具体作用来解答，酶的特点及分类要搞清.答案：（1）限制性核酸内切GAATTC鸟嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸磷酸二酯黏性末端（2）E·coliDNA鸟嘌呤脱氧核苷酸腺嘌呤脱氧核苷酸磷酸二酯T4DNA连接酶【例4】DNA连接酶催化的反应是（）A.DNA复制时母链与子链之间形成氢键B。黏性末端碱基之间形成氢键C.两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接D.A、B、C都不正确解析：本题考查的是DNA连接酶的功能。对于它的功能有个很形象的说法：将梯子两边的扶手的断口处连接起来。实际上就是在相邻的脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键,把两个DNA片段末端之间的缝隙“缝合”起来，而不是在碱基之间形成氢键。答案：C【例5】作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是（）A.能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B。具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C。具有某些标记基因,以便为目的基因的表达提供条件D。能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选解析：本题考查的是载体必须具备的条件及理由，条件与理由必须相符。作为载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表达，必须能够在宿主细胞内稳定地保存并大量复制，以便通过复制提供大量目的基因。同时要具有某些标记基因，是为了通过标记基因是否表达来判断目的基因是否进入了受体细胞，从而进行筛选受体细胞。载体要具有多个限制酶切点，则是为了便于与外源基因连接.答案：A【例6】下列关于质粒的叙述，正确的是(）A。质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B。质粒是独立于