2第二章-生物制药工艺基础

第二章生物制药工艺技术基础

Basisofbiopharmaceuticaltechnology

生化制药工艺技术基础微生物制药工艺技术基础生物技术制药工艺技术基础生物制药中试放大工艺设计生物药物的研究与新药申报本章学习目标掌握：生化活性物质的提取、分离和纯化；

微生物菌种选育和培养。熟悉：生物材料的来源和预处理，浓缩和干燥。了解：生物技术制药工艺的技术基础，

中试放大工艺的概念。天然生化药物：第一节生化制药工艺技术基础原料：人体组织、动物、植物、微生物、海洋生物手段：生物化学原理、方法生物分离工程技术第一节生化制药工艺技术基础一、生物材料：1.动物脏器2.血液、分泌物和其他代谢物，如尿液、胆汁、蛇毒等3.海洋生物4.植物5.微生物，细菌、真菌、放线菌、酵母菌1.动物脏器（1）胰脏（激素、酶、多肽、核酸、多糖、氨基酸等）（2）脑（脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、神经肽等）（3）胃粘膜（胃蛋白酶、胶原蛋白酶、胃泌素、胃膜素）（4）肝脏（酶系、维生素、磷脂类、胆固醇）（5）脾脏（免疫器官，淋巴细胞）（6）小肠（糖蛋白、核苷酸酶、溶菌酶、胃肠道激素）（7）脑垂体（各种激素）（8)心脏（细胞色素C、辅酶Q10）2.血液、分泌物和其它代谢物（1）血液制品：人血制剂、抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，纤维蛋白原，免疫球蛋白、人血浆、干扰素、白介素等（2）尿液、胆汁（3）蛇毒、蜂毒也是重要的生物材料蜂毒蜂毒是一种成分复杂的混合物，它除了含有大量水分外，还含有苦干种蛋白质多肽类、酶类、组织胺、酸类、氨基酸及微量元素等蜂毒的临床应用

1.结缔组织疾病（风温病和类风温性关节炎）

2.神经炎和神经痛（坐骨神经痛、三叉神经痛、枕神经痛、背神经根炎）

3.心血管疾病（高血压动脉粥样硬化症、静脉血栓形成、血栓闭塞性脉管炎和动脉内膜炎）

4.变应性疾病：支气管哮喘3.海洋生物（1）海藻（2）腔肠动物海葵毒素（3）节肢动物甲壳素（4)软体动物多糖、多肽、毒素（5）棘皮动物海星、海胆、海参海参素抗癌（6）鱼类鱼油、多种激素、毒素，硫酸软骨素（7）爬行动物龟滋阴养肾抗肿瘤（8）海洋哺乳动物鲸鱼鱼肝油4.植物生物碱、强心甙、黄酮、皂甙、挥发油、树脂、鞣质等。青蒿素（Qinghaosu,arteannuin）我国科学家从黄花蒿Artemisiaannua

L.叶中得到的新型抗疟疾倍半萜过氧化物1977年3月首次发表了其独特的结构2002年4月复方蒿甲醚被列入WHO第12版基本药物名录的核心目录中国发现者屠呦呦因此获2015诺贝尔生理学或医学奖。5.微生物----微生物菌体细胞内提取物细菌（1）氨基酸（2）有机酸柠檬酸、苹果酸、乳酸（3）糖类葡聚糖、聚果糖、聚甘露糖、脂多糖。（4）核苷酸类5‘－AMP，5’－肌苷酸（5）维生素VB1,VB2，VB6,Vc（6）酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水低、有机物丰富、中性或微碱性的土壤中土壤特有的泥腥味，主要是放线菌的代谢产物所致。（1）抗生素

最重要的抗生素产生菌，已有1000多种抗生素约70%产自放线菌。链霉菌（2）氨基酸（3）核苷酸（4）维生素VB12等（5）

酶蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等真菌（1）

酶（2）有机酸（3）氨基酸（4）核酸及有关物质（5）维生素（6)促生素（7）多糖酵母菌（1）维生素（2）蛋白质与多肽（3）核酸青霉素1928年，亚历山大·弗莱明的幸运发现弗莱明研究葡萄球菌，有一天他的一个培养皿中长了一个霉菌斑，使弗莱明感到惊讶的是，在青霉菌的近旁，葡萄球菌忽然不见了。霉菌渗出了什么强有力的物质？弗莱明称为青霉素他设法培养这种霉菌进行多次抑菌试验1929年，弗莱明发表了他的研究成果，遗憾的是未受到科学界的重视。1938年，德国化学家恩斯特钱恩青霉素提纯实验。1940年，弗洛里和钱恩用青霉素进行动物实验。

二、生物材料的选择：

1．原则：有效成分含量高，原料新鲜、无污染，来源丰富、易得、低廉，杂质含量少、便于分离纯化。2．生物材料的采集、质控与预处理

（1）品种鉴定，并注意该生物自然分布区域；（2）防止污染与感染；（3）采集后快速及时速冻处理；（4）冷冻保存。

三、生物活性物质的提取

（一）几种常用提取方法

1．酸、碱、盐水溶液提取方法→水溶性、盐溶性活性物质

2．表面活性剂提取方法→提取膜结合酶

3．有机溶剂提取→水不溶性活性物质常用有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮、丁醇以及乙醚、氯仿

4.双水相萃取法

5．超临界流体萃取法

生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜等。（二）提取方法与优化

1.溶剂选择

2.选择添加剂①缓冲系统②保护剂；③酶抑制剂。

3.提取条件①温度；②pH；③盐；④表面活性剂。生物材料及其生化活性物质特性：溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、相对密度、粒度、粘度，目的物含量、主要杂质种类及溶解性质、有关酶类特征等四、生化活性物质浓缩与干燥

1.浓缩方法：①盐析，中性盐硫酸铵沉淀蛋白（酶）；②有机溶剂沉淀，生物大分子溶液中加入乙醇、丙酮等，沉淀生物大分子；③高分子脱水，常用高分子材料葡聚糖凝胶、聚乙二醇；④超滤，利用不同孔径的超滤膜；⑤真空减压浓缩或薄膜浓缩优点是生产规模大、蒸发温度低、速度快，目的是除去挥发性溶剂，保持物料生物活性，加速蒸发原理是使液体形成薄膜，增加气化表面积。生化活性物质的热不稳定性世界上最大的具有80m2蒸发面积的薄膜蒸发器。薄膜蒸发器

实验室常用真空旋转蒸发仪。2.干燥

使物质从固体或半固体状经除去存在的水分或它种溶剂，从而获得干燥物品的过程。

干燥的目的：

a.提高稳定性，便于贮存、运输；

b.有一定的规格标准；

c.便于进一步处理。干燥物料中三种水：表面水、毛细管中水、细胞内水。干燥应缓慢进行，使各种存在水逐步去除。干燥速度在温度和压力不变时取决于液体到达表面的速度。物质在空气中的干燥度，即物质平衡湿度，在一定条件下是不变值。干燥方法

①低温真空干燥，在密闭容器中减压干燥，产品疏松、易粉碎；

②喷雾干燥，物质先浓缩成一定浓度

液体，经喷雾后形成雾滴（极大的表面），

产品为粉状；

③冷冻干燥，在低温、低压下，利用

升华性能，包括预冷冻、升华和再干燥。

实验室真空冷冻干燥机

五、生化活性物质的分离与纯化1.生化制药工艺中分离纯化特点:

(1)生物材料组成复杂

(2)目的物含量低

(3)生物活性成分易变性、失活

(4)涉及各种参数，分离方法有很大经验成分

(5)温和的“多阶式”方法，逐级分离（目的是保护目的物活性和结构完整性）

(6)产品验证与化学上纯度概念不完全相同（生物分子环境反应敏感，结构与功能关系复杂）2.分离纯化原理

(1)根据分子形状与分子大小，如差速离心、膜分离、凝胶过滤

(2)根据电荷差异，如离子交换、电泳等

(3)根据分子极性与溶解度大小，如溶剂提取、分配层析、盐析、有机溶剂沉淀等

(4)根据吸附特性，如选择性吸附、吸附层析法

(5)根据生物配基特性，如亲和层析3.分离纯化基本程序与实验设计

生物体内某组分，特别是未知结构组分的分离制备设计：

(1)确定制备物的研究目的，并建立相应的分析鉴定方法

(2)制备物的理化性质和稳定性预备试验

(3)材料处理及抽提方法的选择

(4)分离纯化方法的摸索（优劣指标：产品重量与活性平衡，如酶比活力与溶液中蛋白浓度比例）

(5)产物均一性测定（均一性：所获得的制备物只具有一种完全相同的成分）4.分离纯化方法选择原则（1）粗品分离：大处理量,相对低分辨率。盐析，分级沉淀，萃取，超滤。（2）精制：高分辨率。多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC（快速蛋白液相色谱），电泳或等电聚焦。

第二节微生物制药工艺技术基础

一、菌种的分离与筛选1．含菌样品收集2.富集培养：“投其所好”，“取其所抗”3.菌种纯化：（1）平板划线法（2）稀释平板法4.性能测定（菌种复筛）

（1）平板划线法是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。固体培养基四区划法接种法步骤：

步骤一：接种针先以火焰灭菌法灭菌。

步骤二：轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却。

步骤三：以接种针轻触菌落，使接种针上沾有细菌。

步骤四：更换一个新的无菌营养平板。

步骤五：将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区。

（2）稀释平板法是将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养，待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。二、菌种的选育与保藏1．自然选育

依据自发突变原理，通过不断分离、筛选，除去衰变菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株或高产突变株，达到纯化、复壮、稳定生产目的。单孢子菌悬液的制备→分离→单菌落培养→筛选

2．诱变育种指有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。（1）出发菌株的选择①纯种菌株②具备优良性状的菌株③对诱变剂敏感④菌种生理状态及生长发育时间（2）诱变处理:

①化学诱变②物理诱变③生物诱变（噬菌体）（3）筛选：①随机筛选；②理性化筛选①随机筛选：菌种经诱变处理后，进行平板分离，经培养后随机挑选单菌落，从中筛选出具有优良性状的菌株。摇瓶筛选法筛选自动化和筛选工具微型化②理性化筛选：是应用遗传学和生物化学的原理，根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构，设计筛选方法，定向选出有效的性状突变株。

根据微生物代谢产物的不同，其理化筛选的方法也不同。初级代谢产物高产菌株的筛选方法次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选方法3、现代菌种选育技术①杂交育种②原生质体融合③基因工程技术

杂交育种将两个基因型不同的菌株经接合使遗传物质重新组合，从中分离和筛选出具有新性状菌株的过程。独特的优点：1、遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础、扩大变异范围，获得新品种。2、获得新遗传特性的重组体，可克服因长期诱变造成的生活力下降、代谢缓慢等缺陷，还可提高对诱变剂的敏感性。原生质体融合育种

原生质体融合基因工程育种将某一生物体的遗传信息在体外经人工与载体相连（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一微生物（受体）细胞中，使外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传，筛选获得具有新性状菌株的过程。1、主要用于表达多肽、蛋白类产品。2、不适用一些受多基因控制、代谢途径未完全确证的产品。4.菌种保藏（1）保存目的：防止退化（2）菌种退化检查方法（3）菌种退化防止方法①防止基因突变：如低温保藏②采用双重缺陷型③制作平行的菌种斜面，少传代④分离单菌落，自然筛选⑤选择培养条件（4）菌种保藏方法：①斜面保藏法②液体石蜡保藏法③沙土管保藏法④麸皮保藏法⑤冷冻干燥保藏法⑥液氮超低温保藏法

⑦甘油保藏法⑧孢子滤纸保藏法三、微生物的培养1．微生物生长6大营养要素（1）碳源：提供微生物生长所需碳元素的营养源（2）氮源：提供微生物生长所需氮元素的营养源（3）能源：为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能（4）生长因子：微生物生长代谢必需且不能自行合成的有机物（5）无机盐：磷、硫、钾、镁等（6）水2．微生物培养基–

具备6大营养要素合成:成分明确,稳定,营养单一,价格高,用于实验研究组成物质天然:成分复杂,营养丰富,价格低,来源丰富,工业使用按状态固体:适用于菌种分离和保存半固体:在液体培养基中加入琼脂，用于鉴定菌种液体:发酵工业大规模使用按用途孢子:供菌种繁殖孢子使用的固体培养基种子:一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基发酵:可供菌种生长、繁殖和合成产物培养基：人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。培养基的种类3．灭菌与除菌（1）加热灭菌，高压蒸汽灭菌，121℃、20min或115℃、30min（2）辐射灭菌，紫外线灭菌（3）过滤除菌：为不耐热成分，滤膜过滤等（4）化学灭菌：乙醇、环氧乙烷等、甲醛、新洁尔灭（5）无机盐：磷、硫、钾、镁等（6）水四、发酵过程控制1．主要控制参数（1）物理参数：温度、压力、转速、空气流量、粘度、浊度、料液流量等（2）化学参数：pH、基质浓度、溶氧浓度、氧化还原电位、产物浓度、废气中氧浓度和CO2浓度、关键酶活性等（3）生物参数：菌丝形态、菌体浓度2．发酵方式（1）分批发酵：在一封闭培养系统内含有初始限制量的基质的培养方法。延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期。（2）补料分批发酵：分批培养过程中，连续地或间歇地补加培养基（或某营养），而不从发酵罐中，间断地放出培养液。（3）连续发酵：培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液的过程。3．发酵过程的重要影响参数与控制（1）温度控制：最适生长温度，最适发酵温度。

加热、冷却。（2）pH控制：pH影响微生物生长和酶活性。

缓冲体系、直接补加酸或碱。（3）溶氧控制：

溶氧影响菌体生长和产物合成。

临界氧浓度和最适氧浓度。通气、搅拌。（4）泡沫控制：

培养基中蛋白类表活剂存在，通气搅拌易形成泡沫，影响菌体呼吸、生长代谢，泡沫逃逸还会增加染菌机会。

机械消泡，添加消泡剂（豆油、聚醚消泡剂等）。1、基因工程制药技术基础

基因工程药物制造过程的主要程序是：

获得目的基因→构建DNA重组体→将重组体导入宿主细胞→鉴定筛选阳性克隆→构建基因工程细胞→培养工程细胞→分离纯化表达产物→除菌过滤→半成品检定制剂→成品检定→包装

第三节生物技术药物制造技术基础

一、重组DNA技术原理2．基因工程操作过程：

（1）获得目的基因；（2）构建DNA重组体；（3）将重组体导入宿主细胞；（4）筛选阳性克隆与鉴定；（5）基因工程菌中，目的基因扩增与蛋白表达。

二、基因工程主要操作技术1．目的基因的获得基因组文库中获得cDNA文库中获得PCR扩增法化学合成方法中获得（1）cDNA文库

纯化目的mRNA，逆转录成cDNA①mRNA的分离②cDNA第一链的合成③cDNA第二链的合成④cDNA与载体连接⑤转染或转化⑥筛选目的克隆目的基因的获得：cDNA文库（2）PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）

典型PCR反应包括:①模板变性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（10~30s）③延伸72℃（1kb/min）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5′→3′

延伸。No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon30次循环后靶序列扩增的数量（3）化学合成法

在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。2．DNA重组体的构建根据宿主菌不同，选择基因载体（Vector）（1）E.coli：质粒非表达型pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，λ噬菌体DNA作为载体，非表达型λgt10，表达型λgt11。（2）芽孢杆菌：pUB110pE194和pC194（3）链霉菌：pIJ101pSG5

目的基因与载体连接方法①黏端连接法②平端连接法③TA克隆

头部

尾尾部纤维

蛋白衣壳λ噬菌体3.将重组DNA分子导入宿主细胞采用特定的方法将重组DNA分子转移至适当受体细胞并与之同步增殖（1）DNA重组体导入微生物细胞的方法转化作用：微生物细胞直接吸收外源DNA的过程转导作用：通过温和噬菌体颗粒的释放和感染将重组DNA

转移至宿主内（2）DNA重组体导入动植物细胞的方法物理方法：显微注射、基因枪、电穿孔化学方法：磷酸钙共沉淀法、脂质体法生物学方法：反转录病毒法、原生体融合法4.鉴定带有目的基因的克隆从大量细胞繁殖群体中筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞根据遗传表型差异进行筛选根据重组子的结构特征进行筛选

抗性筛选菌落形态……

5．重组体的表达系统将目的基因克隆至适当的表达载体使其在新的遗传背景下获得活性表达得到特定目的物质（1）原核表达系统

①E.coli；②芽孢杆菌Bacillus；③链霉菌Streptomyces

优点：易大量生产，成本低，周期短

缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met（AUG），有内毒素毒性。大肠杆菌枯草芽孢链霉菌（2）真核表达系统

①酵母表达毕赤酵母（Pichiapsatoris）受甲醇诱导。优点：易培养无毒性，易高密度发酵（100g/L），高表达，成本低，产物可糖基化，有分泌表达。

②动物细胞哺乳动物细胞——CHO（仓鼠细胞）昆虫细胞——家蚕细胞酵母细胞6．表达产物的纯化包含体inclusionbodies:大部分是表达产物，（还有细胞蛋白和膜蛋白）一级结构正确、无活性，不溶于水，可用变溶剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。三、动物细胞工程制药技术基础1、供生产生物技术药物的动物细胞（1）非基因工程动物细胞原代细胞：直接取自动物组织器官，经分散、消化制得的细胞悬液。二倍体细胞系：原代细胞经传代、筛选、克隆得到特性强化细胞株。染色体仍是2n模型。转化细胞系：经某个转化过程形成，染色体变成异倍体，具有无限繁殖能力。（2）基因工程细胞杂种细胞：动物细胞融合技术构建成的，自然或人工将两个或几个不同动物细胞合并成的一个双核或多核细胞。杂交瘤细胞生产单克隆抗体重组细胞：表达载体构建、表达载体导入、表达细胞株筛选2、动物细胞培养营养（培养液）、气体（CO2培养箱）、pH、温度、水质、渗透压、无菌（1）悬浮培养：细胞自由悬浮在培养基中生长增殖。细胞密度较低（2）贴壁培养：细胞附在某种介质上生长繁殖的培养方法。传质、传氧差（3）微载体培养：细胞附在微小颗粒载体上生长繁殖的培养方法。载体比表面积大、比重小，轻度搅拌可自由悬浮。贴壁-悬浮培养法3、动物细胞种质保存种质形式：（1）组织块（2）细胞悬浮物（3）细胞单层培养物保存方式：（1）常温法：20~30℃，单层细胞可保存2周~1个月（2）低温法：4℃，可保持1个月（3）超低温冰冻法：-70℃以下冰箱或液氮中，甘油、二甲基亚砜（DMSO）保护剂四、植物细胞工程制药技术基础1、植物组织与细胞培养

在无菌或人工控制的营养及环境条件（光照、温度等）下，研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。（1）悬浮培养（2）细胞培养（3）分生组织培养，生长锥培养（4）外植体、愈伤组织和毛状根培养（5）器官形成培养2、植物组织和细胞培养基应用最广的培养基：MS培养基，LS培养基无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等成分2、植物细胞转基因技术原理植物细胞具有全能性，如将外源基因整合到植物细胞中，在通过细胞和组织培养，就能获得再生的转基因植株。植物细胞基因转化技术：农杆菌转化技术，利用农杆菌的Ti质粒，T-DNA介导。直接转化技术，基因枪法、电击法、显微注射法、PEG法、脂质体介导法、花粉管通道法等，将外源基因直接导入植物细胞。五、酶工程制药技术基础1、酶工程(enzymeengineering)：酶学与工程学互相渗透结合，发展形成的生物技术，它是从应用目的出发，研究酶和应用酶的特异催化功能，并通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。

研究内容（1）酶的发现、分离纯化与生产应用。（2）酶与细胞的固定化技术与酶反应器。（3）生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。（4）抗体酶、模拟酶、合成酶及酶的人工设计。酶反应示例2、固定化酶(immobilizedenzyme)指借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂，是近代酶工程技术的主要研究领域。广义的固定化酶又包括固定化酶和固定化细胞两类。优点：（1）固定化稳定性提高（2）可重复使用、提高使用效率、降低成本（3）提高强度，便于连续、自动、规模化生产（4）便于产物的分离、纯化固定化酶反应器共价键结合酶固定化可溶交联包埋吸附酶的固定化技术和固定化酶3、制备方法：（1）吸附法：分为物理吸附法和离子交换吸附法。（2）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺（3）共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合。（4）交联法：用双或多功能试剂将酶与载体交联固定化

图:酶固定化方法示意1.离子结合2.共价结合3.交联4.聚合物包埋5.疏水作用6.脂质体包埋7.微胶囊第四节生物制药工艺中试放大设计

一、中试放大目的与规模1．基本要求：（1）建立稳定的制造规程为正式生产提供多种必需的工艺条件与参数；（2）为临床前研究与临床实验的评价提供足量的合格产品；（2）