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第一章发酵工程传统发酵技术的应用考点1:发酵与传统发酵技术1.发酵的概念和种类:(1)概念:人们利用,在适宜的条件下,将原料通过转化为人类所需要的产物。(2)种类:(如醋酸发酵、谷氨酸发酵)和(如酒精发酵)。2.传统发酵技术的概念:直接利用原材料中天然存在的,或利用前一次发酵保存下的面团、卤汁等发酵物中的进行发酵、制作食品的技术。考点2:传统发酵食品的制作1.制作原理:(1)所用菌种。①泡菜:。②果酒:。③果醋:。(2)制作原理。①泡菜:在条件下,乳酸菌将葡萄糖分解为乳酸:C6H12O6→2C3H6O3(乳酸)+能量。②果酒:a.在条件下大量繁殖:C6H12O6+6O2+6H2O→6CO2+12H2O+能量。b.在条件下进行酒精发酵:C6H12O62CO2+2C2H5OH(酒精)+能量③果醋:a.糖源、氧气均充足:将糖分解为醋酸;b.糖源不足、氧气充足:C2H5OH+O2→H2O+CH3COOH(醋酸)+能量(3)常见的发酵产品及其发酵使用的微生物发酵产品微生物代谢类型生物类型繁殖方式腐乳真核孢子生殖泡菜原核分裂生殖果酒真核出芽生殖果醋原核分裂生殖2.控制情况泡菜果酒果醋条件控制O2无氧前期有氧,后期无氧有氧温度室温1830℃3035℃时间腌制15天左右10~12天7~8天其他条件控制盐与水的比例操作提示泡菜坛的选择;腌制条件的控制材料的选择与处理;防止发酵液被污染;控制好发酵条件;正确使用发酵装置3.泡菜制作流程(1):用清水和食盐配制质量百分比为5%20%的盐水,并将盐水煮沸,冷却待用;(2):将新鲜蔬菜洗净,切成块状或条状,混合均匀,晾干后装入泡菜坛内;装至半坛时,加入蒜瓣、生姜及其他香辛料,继续装至八成满;(3):将冷却好的盐水缓缓倒入坛中,使盐水没过菜料,盖好坛盖;(4):向坛盖边缘的水槽中注满水,并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水;根据室内温度控制发酵时间。4.泡菜发酵过程中,乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的含量变化时期乳酸菌乳酸亚硝酸盐发酵前期少(O2抑制乳酸菌活动)少增加(硝酸盐还原菌的作用)发酵中期最多(乳酸菌比其他杂菌更耐酸。乳酸积累,抑制其他菌活动)增多达到最多后开始下降(硝酸盐还原菌受抑制,部分亚硝酸盐被分解)发酵后期减少(乳酸积累,pH下降,抑制乳酸菌活动)继续增多,最后保持稳定下降至保持相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)变化曲线5.果酒和果醋制作流程(1)器具消毒(2):取新鲜葡萄,用清水冲洗12次,再去除枝梗和腐烂的籽粒,沥干;(3):用榨汁机榨取葡萄汁,将葡萄汁装入发酵瓶,盖好瓶盖;(4):将温度控制在1830℃进行发酵,在发酵过程中,每隔12h左右将瓶盖拧松一点(注意:不是打开瓶盖),此后再拧紧瓶盖。发酵时间为1012d。可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行检测。(5):当葡萄酒制作完成后,打开瓶盖,盖上一层纱布,进行葡萄醋的发酵。发酵温度为3035℃,时间为78d。6.比较果酒与果醋制作的过程项目果酒果醋菌种酵母菌醋酸菌温度18~30℃30~35℃时间10~12d7~8d氧气条件排气或充气情况发酵旺盛期的CO2产量非常大,要及时排气,防止发酵瓶爆裂适时通过充气口充气,保证充足的氧气条件气味或味道酒味酸味气泡和泡沫有气泡和泡沫无气泡和泡沫发酵液颜色混浊混浊,液面形成白色菌膜检测指标嗅味和品尝、用酸性重铬酸钾检测酒精含量、测定pH、进行酵母菌的镜检等工作观察菌膜的形成、嗅味和品尝、测定pH、进行醋酸菌的镜检等工作7.果酒制作发酵装置及各部件的作用微生物的培养技术及应用(一)微生物的基本培养技术考点1:培养基的配制培养基(1)概念:人们按照微生物对的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)作用:用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。(3)类型划分标准培养基种类特点用途物理性质不加凝固剂工业生产加凝固剂,如琼脂观察微生物的运动微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种化学成分含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定用途允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物营养成分:凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。①基本成分:碳源、氮源、水、无机盐碳源(自养型生物)CO2、CO32、HCO3(异养型生物)葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等氮源无机氮源NH4+、NO3、NH3等有机氮源牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等无机盐大量元素Ca、K、Mg微量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等【注意】含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源②还需满足微生物对pH、特殊营养物质、氧气的需求A.培养乳酸菌需要添加。B.培养霉菌时需将PH调至,培养细菌时将PH调至或。C.培养厌氧微生物时需要提供条件。考点2:无菌技术目的:。关键:。常用的灭菌、消毒方法比较条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物,不能消灭芽孢和孢子。日常用品不耐高温的液体用酒精擦拭双手,用氯气消毒水源用紫外灯照射接种室、接种箱、超净工作台。灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子接种工具(涂布器、接种环)、试管口或瓶口玻璃器皿、金属用具培养基及容器考点3:微生物的纯培养1.基本概念(1)概念:由繁殖所获得的微生物群体是纯培养物,获得的过程就是纯培养。(2)常用方法:和。(3)纯培养:获得的过程。(4)菌落:分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。(5)单菌落:一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。2.酵母菌纯培养的方法步骤(1)配制培养基:称取去皮马铃薯200g,切成小块,加水1000ml,加热煮沸至马铃薯软烂,用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、1520g琼脂,用蒸馏水定容至1000ml。(2)灭菌:①培养基灭菌:;②培养皿灭菌:。(3)倒平板:待培养基冷却至50左右时,在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作:灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中,倒后立即置于水平位置上,轻轻晃动,使培养基铺满平皿底部,待凝,使之形成平面。【注意】倒平板注意事项:①温度:50℃左右②操作:在酒精灯火焰附近③冷凝后平板倒置。3.平板划线法(1)原理:通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养,可以分离得到单菌落。(2)操作步骤图示①灼烧接种环,直至接种环金属丝烧红②在火焰旁冷却接种环,拔出酵母菌培养液试管的棉塞③试管口通过火焰④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液⑤试管口通过火焰,并塞上棉塞⑥将皿盖打开一条缝隙,用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线,盖上皿盖⑦灼烧接种环,待其冷却后,从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作,作第三、四、五次划线(二)微生物的选择培养基和计数考点1:选择培养基(1)概念:在微生物学中,将特定种类的微生物生长,同时其他种类微生物生长的培养基,称为选择培养基。(2)原理:人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。(3)实例从热泉中筛选出水生栖热菌。热泉70~80℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物,而使耐高温的水生栖热菌脱颖而出。(4)选择培养基配方的设计尿素[CO(NH2)2]含氮量高,化学性质稳定,是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素,是因为能合成脲酶,来催化尿素分解。①你如何设计培养基配方,将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来?【答案】培养基添加尿素作唯一氮源,只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖。考点2:微生物的选择培养1.稀释涂布平板法:将菌液进行一系列的梯度稀释后,将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基表面,进行培养。实例:土壤中分解尿素的细菌的分离与计数提出问题:土壤中有能分解尿素的细菌,我们如何分离它们?并研究1g土壤样品中含有多少这样的细菌?原理:通过对土样进行充分稀释,再将菌液涂布到制备好的培养基上,即可得到能分解尿素的细菌的纯培养物。【实验流程】1.选择培养基的制备(1)原理:绝大多数微生物都能利用葡萄糖,但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以作唯一氮源的选择培养基,可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。(2)配方葡萄糖制备选择培养基(尿素为唯一氮源)制备牛肉膏蛋白胨培养基制备选择培养基(尿素为唯一氮源)制备牛肉膏蛋白胨培养基(对照作用)尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml2.稀释土壤样品(1)土壤取样细菌宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长,绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层。铲去表层土3cm左右,取样,将样品装入事先准备好的信封中。【注意】取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后,一定要洗手。(2)样品的稀释(梯度稀释菌液)将10g土样加入盛有无菌水的锥形瓶中,充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中,依次。(3)稀释涂布平板法操作序号图示操作1取0.1mL菌液,滴加到2将涂布器浸在盛有的烧杯中3将沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼烧,待酒精燃尽、涂布器冷却后,再进行涂布4用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿,使菌液_(4)微生物的培养与观察①不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在的温度下培养12d。②每隔24h统计一次菌落数目,选取稳定时的记录作为结果,防止因。③一般来说,在相同的培养条件下,同种微生物表现出。(5)鉴定培养基①土壤中分解尿素的细菌的鉴定原理:脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→酚红变红→脲酶阳性在以为唯一氮源的培养基中加入指示剂。培养某种细菌后,如果PH升高,指示剂将变红,说明该细菌能够分解尿素。A.液体培养基可以直接看液体的变色情况;B.固体培养基上可以观察菌落周围是否出现,红色环带直径与菌落直径比值越大,说明。考点3:微生物的数量测定1.间接计数法稀释涂布平板法(1)原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过计数平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。(2)计数原则:①选择个菌落的平板进行计数;②每个稀释度至少取个平板取其平均值;③统计的菌落往往比活菌的实际数目低;④统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示;⑤恰当的稀释度、涂布是否均匀是成功统计菌落数目的关键。(3)计算公式:每g样品中的菌落数=(C÷V)×M①C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数;②V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);③M代表稀释倍数。2.直接计数—计数板计数法(1)原理:利用细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。(2)缺点:不能区分死菌与活菌;个体小的细菌在显微镜下难以观察;第三节发酵工程及其应用考点1:发酵工程的基本环节1.发酵工程的概念:利用微生物的特定功能,通过现代工程技术,规模化生产对人类有用的产品。2.发酵工程的特点:生产条件温和;原料来源丰富且价格低廉;产物专一;废弃物对环境的污染小、容易处理等。3.发酵工程的基本环节(1):性状优良的菌种可以从自然界中筛选出来,也可以通过诱变育种或基因工程育种获得。生产柠檬酸就需要筛选产酸量高的黑曲霉。在啤酒生产中,使用基因工程改造的啤酒酵母,可以加速发酵过程,缩短生产周期。(2):工业发酵罐的体积一般为几十到几百立方米,接入的菌种总体积需要几立方米到几十立方米。所以,在发酵之前还需要对菌种进行扩大培养。(3):在菌种确定之后,要选择原料制备培养基。在生产实践中,培养基的配方要经过反复试验才能确定。(4):发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种。一旦有杂菌污染,可能导致产量大大下降。例如,在青霉素生产过程中如果污染了杂菌,某些杂菌会分泌青霉素酶将青霉素分解掉。因此,培养基和发酵设备都必须经过严格的灭菌。(5):将扩大培养的菌种投放到发酵罐中。(6):这是发酵工程的中心环节。在发酵过程中,要随时检测培养液中的微生物数量、产物浓度等,以了解发酵进程。还要及时添加必需的营养组分,要严格控制、和等发酵条件。环境条件不仅会影响微生物的生长繁殖,而且会影响微生物代谢物的形成。例如,谷氨酸的发酵生产:在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸;在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N乙酰谷氨酰胺。(7):如果发酵产品是微生物细胞本身,可在发酵结束之后,采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥,即可得到产品。如果产品是代谢物,可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。考点2:发酵工程的应用应用内容实例食品工业①利用霉菌生产酱油;②利用酿酒酵母生产酒类①利用黑曲霉生产柠檬酸;②利用谷氨酸棒状杆菌生产味精α淀粉酶、β淀粉酶、果胶酶、氨基肽酶和脂肪酶等医药工业生长激素释放抑制激素、乙型肝炎疫苗等农牧业根瘤菌肥、固氮菌肥等利用苏云金杆菌防治农林虫害等用单细胞蛋白制作微生物饲料,能使家畜、家禽增重快,产奶或产蛋量显著提高其他方面利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂,嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量疑难点1:泡菜坛只能装八成满的原因1.在泡菜发酵初期,由蔬菜表面带入的大肠杆菌、酵母菌等较为活跃,会产生较多的CO₂,如果泡菜坛装得太满,发酵液可能会溢出坛外。2.泡菜坛装得太满,会使盐水不太容易完全淹没菜料,从而导致坛内菜料变质腐烂。3.泡菜坛留有一定的空间,也更方便拿取泡菜。疑难2:果酒发酵,发酵罐要留有大约1/3的空间1.先让酵母菌进行有氧呼吸,快速繁殖,耗尽O2后,再进行酒精发酵;2.防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。疑难3:单细胞菌落的获得1.利用平板划线法接种时,单细胞菌落从后划线的区域挑取。2.利用稀释涂布平板法接种时,只有合适的稀释度才能得到单细胞菌落。3.两种接种方法的异同:两种方法都能将微生物分散接种到固体培养基表面,以获得单细胞菌落,达到分离的目的;稀释涂布平板法还能对微生物进行计数。疑难4:选择培养基和鉴别培养基的区别项目选择培养基鉴别培养基特殊成分加入允许目标微生物生长,而抑制或阻止其他微生物生长的化学物质加入某种指示剂或化学药品(不影响微生物正常生长)目的抑制其他微生物的生长,促进目标微生物的生长微生物的某种代谢产物与培养基中的特定指示剂或化学药品发生反应用途培养、分离出目标微生物鉴别目标微生物举例培养酵母菌和霉菌时,可在培养基中加入青霉素,抑制细菌的生长;利用以尿素作为唯一氮源的培养基来培养可分解尿素的细菌可用伊红—亚甲蓝琼脂培养基鉴定饮用水或乳制品中是否含有大肠杆菌(若有,则菌落呈深紫色、并有金属光泽)疑难5:平板划线法的注意事项1.几次灼烧接种环的目的(1)第一次划线前:杀死接种环上的微生物,避免污染培养物。(2)每次划线后:杀死残留菌种,保证每次划线菌种来自上一次划线的末端。(3)划线操作结束后:杀死残留菌种,避免污染环境和感染操作者。2.灼烧接种环之后,要冷却后再进行操作,以免接种环因温度过高而杀死菌种。3.划线力度要适当,防止用力过大将培养基表面划破。4.培养皿盖不能完全打开,应只打开一条缝隙。疑难6:常用微生物分离方法比较比较平板划线法稀释涂布平板法工具接种环涂布器原理通过接种环在琼脂固体培养基的表面连续划线操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。将菌液进行一系列的梯度稀释,稀释度足够高时,聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞。特点方法简单,但不适宜计数单菌落更易分开,可以计数,但操作复杂示意图共同点使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落疑难7:微生物的计数方法比较内容直接计数法间接计数法主要用具显微镜、细菌计数板或血细胞计数板涂布器计数依据细菌个数培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌计算公式每毫升原液含菌株数=每小格平均菌株数×400×10000×稀释倍数每克样品中的菌株数:(C÷V)×MC:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数缺点不能区分死菌与活菌当两个或多个菌体连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落结果比实际值偏大比实际值偏小疑难8:几种常见的鉴别培养基名称主要用途主要化学物质特征性变化伊红一亚甲蓝琼脂培养基鉴别大肠杆菌伊红、亚甲蓝出现带金属光泽的深紫色菌落刚果红培养基鉴别纤维素分解菌刚果红、纤维素纤维素被分解后出现透明圈淀粉培养基鉴别纤维素分解菌可溶性淀粉淀粉被水解后出现淀粉水解圈H2S试验培养基鉴别产淀粉酶菌株鉴别产H2S菌株醋酸铅产生黑色沉淀疑难9:正确区分传统发酵技术与发酵工程项目传统发酵技术发酵工程概念直接利用原料中天然存在的微生物,或利用前一次发酵保存下来的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术利用微生物的特定功能,通过现代工程技术,规模化生产对人类有用的产品菌种来源来源于空气、蔬菜、面团发酵物等,菌种不纯性状优良的菌种,可从自然界中筛选出来,也可以通过诱变育种或基因工程育种获得过程无菌种选育、扩大培养、接种,无严格的灭菌等菌种选育,培养基的配制、灭菌,扩大培养,接种,发酵,产品的分离和提纯发酵条件控制通过微生物自身的代谢调节pH,通过充气口、排气口及其他人工措施调节溶解氧通过计算机控制系统,对发酵过程中的温度、pH和溶解氧等进行监测和控制应用果酒、果醋的制作,腐乳、泡菜的制作等应用于食品工业、医药工业、农牧业等传统发酵技术及应用的高考题常结合有关微生物的代谢特点,考查泡菜、果酒和果醋的制作原理、制作过程及发酵条件的控制。试题可以以教材具体事例为素材对基础知识进行考查,也可以以与人们生活紧密相关的食品制作过程为情境考查同学们运用基本知识和基本的实验方法解决实际问题的能力。微生物的培养技术及应用,本节内容属于实际应用部分,对考生要求较高。要求考生掌握培养基的种类、配制原则及无菌技术的操作,学会用选择培养基筛选微生物;掌握微生物分离的原理和方法步骤;掌握测定某种微生物数量的方法。本节内容常和前一节内容一起考查,多以非选择题形式出现,题目难度中等。发酵工程及其应用,本节内容在新课程标准中的要求:能够举例说明日常生活中的某些食品是运用传统发酵技术生产的;阐明发酵工程利用现代工程技术及微生物的特定功能,工业化生产人类所需产品;举例说明发酵工程在医药、食品及其他工农业生产上有重要的应用价值。本节内容常结合前面的传统发酵技术、微生物的培养以及后面将要学习的基因工程进行考查,主要考查学生的综合应用能力。【真题在再现】1.(2023·河北·统考高考真题)为筛选能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌,下列相关实验设计错误的是(

)A.从酸奶和泡菜中采样分离乳酸菌 B.平板倒置培养为筛选乳酸菌创造无氧环境C.对目的菌株进行胆固醇降解能力的测定 D.检测目的菌株对消化道环境的耐受力2.(2023·重庆·统考高考真题)垃圾分类有利于变废为宝,减少环境污染。如图为分类后餐厨垃圾资源化处理的流程设计。下列叙述错误的是(

)A.压榨出的油水混合物可再加工,生产出多种产品B.添加的木屑有利于堆肥体通气,还可作为某些微生物的碳源C.X中需要添加合适的菌种,才能产生沼气D.为保证堆肥体中微生物的活性,不宜对堆肥体进行翻动3.(2023·辽宁·统考高考真题)细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度(菌落数/m³)。下列叙述错误的是(

)A.采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理B.细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置C.同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值D.稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高4.(2023·辽宁·统考高考真题)利用某种微生物发酵生产DHA油脂,可获取DHA(一种不饱和脂肪酸)。下图为发酵过程中物质含量变化曲线。下列叙述错误的是(

)A.DHA油脂的产量与生物量呈正相关B.温度和溶解氧的变化能影响DHA油脂的产量C.葡萄糖代谢可为DHA油脂的合成提供能量D.12~60h,DHA油脂的合成对氮源的需求比碳源高5.(2021·江苏·高考真题)某同学选用新鲜成熟的葡萄制作果酒和果醋,下列相关叙述正确的是(

)A.果酒发酵时,每日放气需迅速,避免空气回流入发酵容器B

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