3.2基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

DNA片段的扩增及电泳鉴定DNA片段的扩增及电泳鉴定一、实验原理PCR（聚合酶链式反应）：DNA的半保留复制PCR利用了DNA的热变性的原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。一、实验原理琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是常用的分离、鉴定DNA的方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。分子筛效应：分子的大小和形状不同，通过一定分子孔径分离时因受阻的程度不同而表现出不同的迁移速率DNA分子可发生两性解离。当电泳缓冲液的pH大于其等电点时，DNA分子带负电；当电泳缓冲液的pH小于其等电点时，DNA分子带正电。

一般使用的电泳缓冲液的pH为8，

DNA分子带负电，向正极泳动DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。一、实验原理琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳是常用的分离、鉴定DNA的方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构象。1、配置反应体系课程导入课程导入10倍浓缩的扩增缓冲液5uL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1uL20umol/L的引物I2.5uL20umol/L的引物Ⅱ2.5uLH2O28~33ul1-5U/uL的TaqDNA聚合酶1~2U模板DNA(用量为1pg-1ug)5~10uL总体积50uLU:酶活性单位(在最适温度下，每分钟内催化1umol底物转化为产物所需的酶量定位一个活力单位)（含Mg2+)(dNTP)二、实验步骤微量移液器课程导入————调节轮————推动按钮——-卸尖按钮————-容量视窗————卸尖器————-活塞杆————-移液尖（吸头）6个步骤1、容量设定2、吸液枪头安装3、预洗吸液枪头4、吸液5、放液6、卸去吸液枪头2、离心课程导入课程导入离心：所有组分加入完毕后，盖严离心管盖，并将其放入离心机中，离心约10s中，使反应液混匀并集中在离心管底部。（提高反应速率）离心？3、设置PCR仪的循环程序3、设置PCR仪的循环程序课程导入预变性？循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min——30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min使DNA充分变性以利于引物更好的与模板结合课程导入PCR的循环程序第一次循环第二次循环第三次循环4、配置琼脂糖溶液根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料（溴化乙锭EB）混匀。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。4、配置琼脂糖溶液：jiangwe5、制备凝胶：jiangwe制备凝胶：5、将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，形成加样孔。6、待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳7、将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜（检查有无气泡）电泳指示剂：溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，凝胶载样缓冲液作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。8、加样：一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。jiangwe8、加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。jiangwe8、加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。jiangwe9、电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压一般为1~5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。(一般向正极移动)jiangwe三、观察实验结果：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相课程导入琼脂糖凝胶电泳结果在本实验中，主要考虑DNA分子的迁移速率与其大小成反比。课程导入未出现扩增条带可能原因：四、实验结果分析1、模板DNA含有杂蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制剂（如蛋白酶K、苯酚、EDTA)?；2、TaqDNA聚合酶失活；3、引物出现质量问题，浓度不合适;4、Mg离子浓度过低;5、变性温度低，变性时间短；等等。课程导入出现非特异性扩增条带可能的原因：四、实验结果分析1、模板DNA出现污染;2、TaqDNA聚合酶出现质量问题;3、Mg离子浓度过高；4、退火温度（复性时的温度）过低；5、PCR循环次数过多；等等。课程导入注意事项1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。

2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20

℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。

4.

在进行操作时，一定要藏好一次性手套。

避免反复冻融核酸检测课程导入新型冠状病毒核酸检测：在进行新型冠状病毒核酸检测时，主要是使用一次性棉签经口腔或鼻腔来采取深处的细胞进行检测。医护人员会将患者的采集标本进行实时荧光RT-PCR检测，如果检测结果为阳性，则代表感染了新型冠状病毒。如果检测结果为阴性，则代表没有感染新型冠状病毒。

RT-PCR：先得到RNA，反转录成DNA，再PCR。

应用刑事案件中的运用：应用PCR技术对多态DNA位点分型，使犯罪现场生物物证