3.1基因工程-DNA粗提取与鉴定课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

DNA的粗提取及鉴定一、实验原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。构成染色体的核蛋白加速解聚，游离出DNA分子，并使DNA分子充分溶解于Nacl溶液中。Nacl溶液为2mol/L时，DNA溶解，而部分蛋白质发生盐析生成沉淀，通过过滤，可除去部分蛋白质及不溶于Nacl溶液的杂质Nacl溶液为0.14mol/L时,DNA析出，过滤可除去溶于Nacl中的部分蛋白质和杂质。Nacl蛋白质在Nacl溶液浓度从2mol/L降低的过程中，溶解度逐渐增大一、实验原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。（鉴定）（现用现配）沸水浴加热1.选择适宜的材料2.破碎细胞4.提纯5.验证3.提取二、实验思路1.选材：新鲜洋葱为什么用洋葱呢，其他实验材料可以吗？三、实验步骤红细胞成熟的红细胞这些生物组织是否适宜用作实验材料？DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等

不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，不含DNA1.选材：注意：操作步骤简便实验材料是否容易保存等实验经费1.选材：实验试剂：研磨液2.破碎细胞实验工具：研钵EDTA（乙二胺四乙酸）：是一种能与二价金属离子结合的螯合剂，而大多数核酸酶需要镁离子，因此可以作为DNA酶的抑制剂，防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。Tris-Hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）：缓冲体系，DNA在这个缓冲体系呈稳定状态。（ph=8)SDS(十二烷基硫酸钠）：是一种阴离子去污剂，可以裂解细胞。常见于洗涤剂研磨液的成分使蛋白质变性，染色体解离。2mol/LNacl:溶解DNA1.选材：实验试剂：研磨液使蛋白质变性与DNA分离，防止细胞破碎后DNA酶降解DNA,DNA在缓冲体系中呈稳定状态2.破碎细胞实验工具：研钵2.破碎细胞？研磨液破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中3.提取DNA(过滤或者离心）？上清液中有什么物质呢？DNA会被吸附到滤纸上DNA不溶于酒精，但有些蛋白质，脂质溶于酒精。在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中会出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。预冷的酒精：一是抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂4.纯化用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物晾干。搅拌时应轻缓、并沿一个方向：减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。4.纯化用高浓度盐溶液溶解DNA，可以去除在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解和析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。还有什么方法去除杂质？二苯胺试管编号A组（对照组）B组（实验组）步骤1物质的量浓度为2mol/L的Nacl溶液5ml步骤2不进行任何处理加丝状物或沉淀物步骤3加4ml二苯胺试剂，混匀步骤4沸水浴加热5min实验现象4.鉴定（定性）如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。溶液不变蓝溶液逐渐变为蓝色了解—鉴定（定量）原理：DNA溶液与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在一定波长范围内，化合物蓝色的深浅与DNA的含量成比例关系，可用比色法测定。分光光度计入射光强度Io透射光强度I样品池

（吸收池）检测器及仪表单色器光源工作原理1.标准曲线的绘制取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂:混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。012345DNA标准液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.00.80.60.40.20二苯胺试剂2.02.02.02.02.02.0方法步骤2.样品测定吸取DNA样液1ml,加入二苯胺溶液2.0ml，加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。方法步骤了解—鉴定(紫外吸收法）原理：核酸类物质含有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基具有共轭双键，在紫外区260nm处有最高吸收峰。紫外吸收法是实验室中最常用的定量测定DNA或RNA的方法。对待测样品的纯度也可用紫外分光光度法进行鉴定。纯DNA的A260/A280应大于等于1.8，样品中如含有杂蛋白，

A260/A280即明显。定量测定时，通常以A260值为1相当于50μg/ml双螺旋DNA，或40μg/ml单链DNA（或RNA）进行换算。降低粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。进一步纯化例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。CTAB去除蛋白，多糖，酚类四.结果分析DNA的粗提取与鉴定实验原理DNA不溶于乙醇，蛋白质溶于乙醇DNA在不同浓度的Nacl溶液中溶解度不同DNA与二苯胺呈现蓝色反应DNA的粗提取选择适宜材料破碎细胞DNA的溶解和析出DNA的纯化鉴定DNA与二苯胺混合，沸水浴，呈现蓝色反应应用亲子鉴定应用核酸检测应用精准医疗香蕉中DNA的粗提取实验①取一段长约2cm的去皮香蕉，剪碎置于玻璃杯中。②加入10mL温水，2g食盐，5滴洗洁精，充