血液学检验技术 课件 5.项目五：骨髓其他检验

单元一：造血细胞检验项目五：骨髓其他检验目录任务一：骨髓活检任务二：流式细胞仪检测任务三：细胞遗传学检查任务四：分子生物学检查项目五：骨髓其他检验

学习目标1.掌握：骨髓活检、流式细胞学检测、染色体检查、荧光原位杂交及荧光定量PCR的临床意义及正常骨髓相关检测结果的判断标准。2.熟悉：流式细胞学检测、荧光原位杂交及荧光定量PCR的检测原理。3.了解：骨髓活检、流式细胞学检测、染色体检查、荧光原位杂交及荧光定量PCR检测的流程，了解异常结果的临床意义。项目五：骨髓其他检验骨髓组织病理学检查又称骨髓活体组织检查（bonemarrowbiopsy，BMB）简称骨髓活检，是观察骨髓组织结构和细胞在骨髓中的空间定位，骨髓穿刺涂片和骨髓组织切片进行细胞形态学检查互为补充，联合应用可提高血液病诊断的准确性。项目五：骨髓其他检验任务一：骨髓活检骨髓穿刺和骨髓活检比较

骨髓穿刺骨髓活检取材方式用骨髓穿刺针抽吸骨髓液，制备骨髓涂片，瑞-姬染色后备检用骨髓活检针吸取骨髓组织，固定包埋切片，姬姆萨等染色后备检优点1.操作较简便2.涂片中细胞分布均匀，胞体舒展，染色良好，较易分辨各系原始和幼稚细胞及其微细结构3.易于识别巨型变，巨幼样变和小巨核细胞4.细胞化学染色效果好，结果可量化1.保持造血组织的天然结构，易于判断红髓和脂肪组织的比例2.可全面了解骨髓增生程度、有核细胞密度及其分布3.可避免骨髓液稀释4.对骨髓纤维化、毛细胞白血病有确诊价值，能提示骨髓增生异常综合征向急性粒细胞白血病的转化，可用于“干抽”的鉴别缺点1.造血组织的天然结构遭到破坏，不能判断红髓与黄髓的比例2.如抽吸过猛，易导致骨髓液稀释3.不能分析“干抽”的原因1.有核细胞群集，不易区分原始和幼稚细胞的类型2.难以观察细胞内的微细结构3.细胞化学染色结果难以量化项目五：骨髓其他检验任务一：骨髓活检

骨髓活检的适应证

（一）多次骨髓穿刺失败。（二）鉴别全血细胞减少性疾病，如再生障碍性贫血、低增生性白血病等。（三）可疑罹患骨髓纤维化、骨髓增生异常综合征、原发性血小板增多症、

真性红细胞增多症、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、淀粉样变性、转移

瘤等疾病（四）判断急性白血病的化疗效果，以及骨髓移植前、后的动态观察。除血友病和严重血小板减少症外，目前骨髓活检尚无绝对的禁忌证。项目五：骨髓其他检验任务一：骨髓活检骨髓活检标本的制备与观察

（一）骨髓活检的取材骨髓活检取材部位常采用髂后上棘。皮肤经消毒、局麻后，将套有针芯的的骨髓活检针刺过皮肤，进入骨皮质，感觉阻力减弱再推进1cm左右，抽出针芯，做骨髓液抽吸涂片。然后套上活动套管，插回针芯，将活检针再推进2~3cm，将针管顺时针和逆时针各旋转3～5圈，使针管内的骨髓组织与周围脱离。以一定方向旋转拔出活检针，取出活动套管，插入针芯，推出骨髓组织块（约米粒大小），标本立即放入Bouin液或福尔马林液固定并送检。项目五：骨髓其他检验任务一：骨髓活检骨髓活检标本的制备与观察（二）骨髓活检标本的制备和染色骨髓活检其主要制备程序包括固定、脱水、包埋和切片。石蜡包埋方法还需脱钙处理。常用的骨髓活检标本染色有Giemsa染色、May-GrünwaldGiemsa（MGG）染色、苏木素-伊红（HE）染色及苏木素-Giemsa-酸性品红（HGF）染色，特殊染色包括Gomori网状纤维染色、淀粉样物质染色、Masson胶原纤维染色。骨髓活检标本石蜡包埋切片还可进行免疫组织化学染色。项目五：骨髓其他检验任务一：骨髓活检骨髓活检标本的制备与观察（三）骨髓活检切片的血细胞定位骨髓组织由实质和间质两部分组成，实质为造血细胞，包括各阶段的红系、粒系、巨核系细胞及淋巴细胞、单核细胞等；间质由网状—巨噬细胞、网硬蛋白纤维支架、血管系统和脂肪细胞组成，主要对造血细胞起支持和营养作用。项目五：骨髓其他检验任务一：骨髓活检在正常骨髓活检切片的细胞组分中，具有严格的局部解剖与血细胞定位。伴吞噬功能的网状-巨噬细胞实体，以及形成网眼的网硬蛋白纤维支架，外加血管系统和脂肪细胞共同构成骨髓间质。造血细胞散布于网眼及血管外间隙内。项目五：骨髓其他检验任务一：骨髓活检骨髓活检的临床价值

（一）全面了解骨髓的组织结构、间质成分的变化，准确判断骨髓增生程度、粒/红比例及骨髓储存铁情况，对某些血液病，如再生障碍性贫血、缺铁性贫血及MDS等明确诊断。（二）发现骨髓穿刺涂片不易发现的病理变化，对某些以骨髓局部病变为特征的疾病，如骨髓纤维化、骨髓坏死、淀粉样变性、肉芽肿病及多发性骨髓瘤等尤为重要。（三）明确“干抽”原因，鉴别是否为骨髓增生低下、骨髓纤维组织增生、或髓腔因增生极度活跃引起“塞实”所致，骨髓活检具有重要意义。项目五：骨髓其他检验任务一：骨髓活检（四）对各种急、慢性白血病和MDS的确诊和预后判断有重要价值，对骨髓转移癌、恶性组织细胞病、戈谢病和尼曼一匹克病等的诊断率比骨髓涂片高。（五）协助诊断慢性骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症等。项目五：骨髓其他检验任务一：骨髓活检骨髓活检的临床价值

1.骨髓各系细胞不同系列来源表达的不同抗原(淋巴系、红系、髓系、浆细胞等)。2.细胞在由原始细胞逐渐分化为成熟细胞过程中，不同阶段表达的不同抗原。因此：明确白血病细胞的系列来源及分化程度，确定免疫分型。诊断的符合率达90%

I——免疫学Immunology

手段：流式细胞仪+细胞免疫组化染色MICM分型采用的实验技术项目五：骨髓其他检验任务二：流式细胞仪检测喷嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液项目五：骨髓其他检验任务二：流式细胞仪检测流式细胞术（FCM）基本原理PMT1PMT2PMT5PMT4DichroicFiltersBandpassFiltersLaserFlowcellPMT3ScatterSensorSample流式细胞术（FCM）基本原理项目五：骨髓其他检验任务二：流式细胞仪检测淋巴单核粒细胞SSC原始嗜碱嗜酸BlastwindowsCD45项目五：骨髓其他检验任务二：流式细胞仪检测流式细胞术（FCM）基本原理流式细胞仪的临床应用1．白血病和淋巴瘤免疫分型应用流式细胞术可快速确定白血病和淋巴瘤细胞膜或胞质内的抗原，尤其对白血病免疫学分型更有意义，急性髓细胞白血病表达髓系抗原，如CD13、CD15、CD33、CD34、HLA-DR。急性淋巴细胞白血病表达淋巴系统抗原，如B-ALL表达CD10、CD19、CD22、HLA-DR、SmIg等；T-ALL表达CD2、CD3、CD7、TdT。随着新白血病细胞抗原的发现，对白血病和淋巴瘤的诊断、治疗、病情观察和预后判断更有价值。项目五：骨髓其他检验任务二：流式细胞仪检测流式细胞仪的临床应用2.微小残留病检测微小残留病(minimalresidualdisease，MRD)是指恶性血液病经治疗达到血液学完全缓解后体内残存的不能通过形态学等传统方法检测到的任何水平的微量肿瘤细胞状态。基于目前的检测技术，MRD的新定义为：measureableresidualdisease，即可检测到的残留病。MRD是疾病复发的根源，流式通过监测MRD水平，来监测患者的肿瘤负荷情况，有助于预后评估和个体化治疗，对高复发风险的患者可及时调整化疗方案和强度，对低复发风险的患者可避免过度治疗引起的毒副作用。项目五：骨髓其他检验任务二：流式细胞仪检测3.CD34+造血干细胞计数FCM精确检测CD34+细胞的绝对值计数，对确定造血干细胞的采集时机、判断移植后植活和免疫重建状态非常重要。4.阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）诊断FCM检测是诊断PNH的金标准。锚链蛋白检测是常规的流式检测方法：PNH与血细胞膜上缺乏糖基磷脂酰肌醇（GPI）“锚”相关联的膜蛋白有关，CD55和CD59是补体调节过程中起重要作用的GPI蛋白，应用FCM技术测定CD55、CD59有助于PNH的诊断。FLAER检测是高敏检测方法：用荧光素标记的气单胞菌溶素(FLAER)特异性的与CD55、CD59等锚链蛋白进行结合，应用血细胞系列抗原和FLAER的共表达情况，确定PNH克隆细胞。健康人外周血单核细胞和中性粒细胞FLAER表达完全阳性，PNH患者单核细胞和中性粒细胞FLAER表达出现缺失。项目五：骨髓其他检验任务二：流式细胞仪检测流式细胞仪的临床应用5．血小板疾病诊断

通过测定血小板膜糖蛋白GPIb-IX（CD42b-CD42a）、GPIIb-IIIa（CD41-CD61）对巨大血小板综合症和血小板无力症具有诊断意义。FCM检测血小板活化比血小板活化指标（如β-TG、PF4、GMP-140）在血栓性疾病、DIC的诊断中更有价值。6．DNA分析

采用FCM测定骨髓细胞、血细胞及其它肿瘤细胞DNA的相对含量，可描绘DNA含量的分布曲线，得到细胞增殖周期如S期、G期、G2+M期细胞的百分比，尤其对白血病、肿瘤细胞动力学的了解更重要。通过DNA分析，可动态监测化疗前后细胞内DNA的含量变化，为指导初治或复发白血病患者及时选用或更换化疗方案提供依据。项目五：骨髓其他检验任务二：流式细胞仪检测流式细胞仪的临床应用AML-M1流式图项目五：骨髓其他检验任务二：流式细胞仪检测细胞遗传学检验主要包括染色体非显带技术、显带技术、荧光原位杂交技术（FISH）等，已用于血液病的诊断、分型、治疗方案的选择，在预后判断和微小残留病灶的检测等方面发挥着重要作用。自动化染色体分析技术提供了菜单式操作，简单易行，在资料存储、染色体图象处理和核型分析方面显示了独特优势，提供了高效、快速和方便的细胞遗传学研究手段。FISH将分子探针与染色体杂交，不仅用于分裂中期细胞，而且可检测分裂间期细胞，拓展了检测范围，提高了灵敏度。项目五：骨髓其他检验任务三：细胞遗传学检查染色体非显带技术

非显带染色体是显带染色体的基础。制备染色体的关键是获取足够的分裂中期细胞。人体增殖细胞如骨髓可直接得到分裂中期细胞，而外周血淋巴细胞需经体外培养，再用植物凝集素（PHA）刺激分裂而获得中期细胞。项目五：骨髓其他检验任务三：细胞遗传学检查染色体显带技术

经特殊处理或特异性染色后，染色体上可显示出一系列连续的明暗条纹，称显带染色体（bandingchromosome）。1971年巴黎会议确定四种显带技术是喹吖染色法（Q带）、Giemsa法（G带）、逆相Giemsa法（R带）和着丝粒区异染色质法（C带）。显带染色技术克服了染色体的识别因难，为研究染色体的异常和基因定位奠定了基础。项目五：骨髓其他检验任务三：细胞遗传学检查染色体异常

染色体异常（chromosomeaberration）又称染色体畸变，包括数目异常和结构异常。1．染色体数目异常人类体细胞常染色体为46条，称二倍体①多倍体②非整倍体③嵌合体。2．染色体结构异常

①缺失②倒位③易位④环状染色体。⑤等臂染色体⑥脆性位点。项目五：骨髓其他检验任务三：细胞遗传学检查

利用DNA碱基互补配对原理，将标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况。荧光原位杂交技术（FISH，Fluorescenceinsituhybridization）项目五：骨髓其他检验任务三：细胞遗传学检查FISHMICM实验技术—FISH项目五：骨髓其他检验任务三：细胞遗传学检查PML/RARA探针RARA基因(retinoicacidreceptor-

，RARA)：维甲酸受体基因，位于17号染色体上。项目五：骨髓其他检验PML基因（promyelocyticleukaemia，PML）：早幼粒细胞白血病基因,位于15号染色体上。PML/RARA融合基因：抑制野生型RARA的正常功能，阻断细胞分化，细胞发生持续增殖。任务三：细胞遗传学检查阴性阳性MICM实验技术—FISH项目五：骨髓其他检验结果判断方法任务三：细胞遗传学检查性染色体探针用于监测性染色体错配的骨髓移植效果

男性患者骨髓移植前男性患者骨髓移植后MICM实验技术—FISH项目五：骨髓其他检验任务三：细胞遗传学检查MICM分型采用的实验技术

M--分子生物学Molecularbiologylogy

手段：多聚酶链反应（PCR）+基因测序PCR已知基因突变的检测项目五：骨髓其他检验任务四：分子生物学检查实时荧光定量PCR的检测原理是在PCR反应体系中加入荧光标记探针或荧光染料。这些荧光物质有其特定的波长，仪器可以自动检出。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，荧光强度增强一倍。因此利用荧光信号积累，我们可以实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。RQ-PCR检测原理项目五：骨髓其他检验任务四：分子生物学检查项目五：骨髓其他检验任务四：分子生物学检查RQ-PCR检测原理结果判断

荧光阈值和Ct值是实时荧光定量PCR的重要参数。荧光阈值是指PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时设定的荧光值，高于阈值的荧光信号被认为是真实信号。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系:每个模板的Ct值与该模板的起始浓度的对数存在线性关系，起始浓度越高，Ct值越小，反之亦然。利用已知起始浓度的标准品可做出标准曲线。因此，只要获得未知样品的Ct值