微生物学检验技术 课件 9项目九：常用培养基制备

项目九常用培养基制备学习目标1.掌握细菌的生长繁殖特征、生长曲线的概念以及四个时期的特点。2.掌握条件致病菌与菌群失调的基本概念。3.熟悉消毒与灭菌的基本原理。4.了解常用培养基的基本配制方法。5.树立正确的无菌操作观念和无菌操作的能力。项目九常用培养基制备思维导图项目九常用培养基制备一、细菌的生理项目九常用培养基制备概述1.细菌具有与其它生物相似的细胞结构和化学组成。2.细菌以无性二分裂方式进行繁殖，人工培养的细菌会出现典型的生长曲线。3.不同种类的细菌具有不同的酶系统，代谢途径不同，一些特殊的代谢产物可用来鉴定细菌。4.正常菌群可对人体发挥营养、生物拮抗、免疫等作用。5.培养基按照用途可分为基础培养基、加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。项目九常用培养基制备1.化学元素

化学元素是构成所有生物的物质基础。根据各类化学元素所占比例的大小，可将其分为：一、细菌的生理（一）细菌的化学组成主要元素：碳、氢、氧、氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁等微量元素：钠、锌、锰、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等2.化学成分及分各种化学元素主要以有机物、无机物和水的形式存在于细菌细胞内，构成细菌生命体的各种组分水：占细胞在总重量的75-90%；有机物：蛋白质、糖类、脂类等无机物：钾、钠、铁、镁、钙、氯等；核酸：DNA、RNA特殊组分：肽聚糖、胞壁酸、磷壁酸、脂多糖等一、细菌的生理（一）细菌的化学组成1.带电现象革兰阳性菌等电点pH为2～3，革兰阴性菌的等电点pH为4～5。细菌一般多处于弱碱性、中性或弱酸性条件，因此细菌表面一般带负电荷。由于革兰阳性菌细胞壁中含磷壁酸较多，因此带负电荷更多。细菌的带电现象与细菌的染色反应、凝集反应、抑菌和杀菌作用有密切关系。一、细菌的生理（二）细菌的物理性状2.光学性质：细菌无色半透明，光线照射细菌时，一部分被吸收，一部分被折射，故菌液呈混浊状。单位体积中的细菌数量与浊度成正比，可用比浊法或分光光度计估计细菌数。3.渗透压：细菌体内含有高浓度的营养物质和无机盐，处于高渗状态。在纯水中菌体因吸水而胀裂。在高渗透环境中，菌体水分逸出，胞浆不能生长繁殖。

4.半透性：细菌细胞壁、细胞膜均有半透性，水及小分子物质可通过，有利于吸收和排出。5.表面积：细菌体积微小，但单位体积的表面积远比其他生物细胞要大，有利于细菌与外界进行物质交换，故细菌代谢旺盛，生长繁殖迅速。一、细菌的生理（二）细菌的物理性状1.环境条件：（1）适宜的酸碱度：多数菌：一般为pH7.2～7.6嗜碱：霍乱弧菌pH8.4～9.2嗜酸：结核分枝杆菌pH6.5～6.8一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢1.环境条件：（2）合适的温度：嗜冷菌:-5－30℃最适温度：10～20℃嗜温菌:10－45℃最适温度：20～40℃嗜热菌:25－95℃最适温度：50～60℃一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢1.环境条件：（3）必要的气体环境：

专性需氧菌：如结核杆菌专性厌氧菌：如破伤风梭菌、脆弱类杆菌兼性厌氧菌：大多数病原菌微需氧菌：如空肠弯曲、幽门螺杆菌一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢2.细菌生长繁殖的规律：（1）细菌的繁殖方式：无性二分裂（2）细菌的生长曲线：将一定数量的细菌接种中在适当的培养基，研究细菌生长过程的规律，以培养时间为横坐标，培养物中活菌数的对数为纵坐标，得出一条生长曲线。一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢2.细菌生长繁殖的规律：（2）细菌的生长曲线：1）迟缓期（A-B）2）对数生长期(B-C)3）平稳期(C-D)4）衰亡期(D-E)一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢3.细菌的代谢：（1）分解代谢：

是指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并伴随能量释放的过程。（2）合成代谢：是指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程，是耗能过程，能量来源于分解代谢过程中产生的能量。

将两者紧密结合在一起的称为中间代谢。一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢3.细菌的代谢：（3）能量代谢：

根据生物代谢过程中受氢体的不同，细菌的生物氧化可分为有氧呼吸、无氧呼吸及发酵。1）有氧呼吸：此过程需要氧气作为最终受氢体，把糖类等有机物彻底氧化分解，产生出二氧化碳和水，同时释放出大量的能量。2）无氧呼吸：此过程是以除氧以外的其它无机物作为受氢体，把糖类等有机物分解成为不彻底的氧化产物，同时释放出少量能量。3）发酵：将自身的某些代谢产物作为受氢体，同时将后者还原成发酵产物。一、细菌的生理（三）细菌的生长与代谢二、微生物的分布项目九常用培养基制备二、微生物的分布（一）陆生环境微生物的分布：土壤微生物的数量和分布主要受到营养物、含水量、含氧量、温度、pH等因素的影响，集中分布于距地表10~20cm的耕作层，其中大部分为非致病菌，也有一部分来自人和动物体内的病原菌。（二）水生环境微生物的分布：水中的细菌群有水中天然的微生物群，也有来自土壤、尘埃、垃圾、人和动物排泄物中的微生物。水的来源及状态决定了微生物分布的种类和数量。（三）空气中微生物的分布：空气中微生物绝大部分来源于人和动物呼吸道产生的飞沫、进入大气的土壤尘粒、污水产生的气溶胶等。二、微生物的分布1.正常菌群：正常人体的体表及与外界相通的腔道都有一定数量和种类的微生物寄生，这些微生物在正常情况下对机体无害，甚至有益，称之为正常微生物群或正常菌群。（四）人体中微生物的分布二、微生物的分布（四）人体中微生物的分布♦体表皮肤♦与外界相通的腔道分布于二、微生物的分布正常菌群的生理意义：（1）营养作用：合成维生素、蛋白质、氨基酸、叶酸等物质（2）生物拮抗：阻止病原菌定居、繁殖（3）免疫作用：促进免疫器官成熟（4）生长发育作用：有利于宿主的生长、发育和长寿。（5）抗癌作用：可使致癌物质转变为非致癌物质。（四）人体中微生物的分布1.正常菌群：二、微生物的分布2.条件致病菌与菌群失调症：（1）条件致病菌：指的是正常情况下不致病，但是在某些特定条件下可致病，这样的菌群称为条件致病菌或机会致病菌。可导致其致病的特定条件包括：①寄居部位改变。②机体抵抗力降低。③菌群失调。菌群失调（dysbacteriosis）是指机体某部位正常菌群中各菌种间的比例发生较大幅度变化，由生理性组合转变为病理性组合的状态。（四）人体中微生物的分布二、微生物的分布2.条件致病菌与菌群失调症：（2）菌群失调症：由于菌群失调而导致的宿主出现一系列临床症状，称为菌群失调症或菌群交替症。菌群失调的发生多见于使用抗生素、医疗措施使用不当和慢性消耗性疾病等。（四）人体中微生物的分布二、微生物的分布3.致病菌：细菌的致病性是对特定宿主而言，致病菌(Pathogenicbacteria)是指能使宿主致病的细菌，反之则为非致病菌，但是二者并无明显界限。有些细菌在一般情况下不致病，但是在特定情况下就致病，我们称其为条件致病菌或机会致病菌。（四）人体中微生物的分布三、消毒与灭菌项目九常用培养基制备三、消毒与灭菌1.消毒（disinfection）：利用某种物理或化学方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的方法。2.灭菌（sterilization）：是指利用某种方法杀死物体中所有微生物（病原微生物、非病原微生物和细菌芽胞）的一种措施。3.防腐（antisepsis）：指应用化学或者物理的方法抑制微生物生长的一种方法。4.抑制（inhibition）：在某种药物亚致死剂量作用下导致微生物生长停止，在去掉这种药物之后生长仍可以恢复的生物学现象。5.无菌操作：无菌指的是没有活着的微生物存在。无菌操作是指在操作的所有环节都没有微生物的污染的方法。（一）基本概念1.两者要求达到的处理水平不同：消毒只要求杀灭或/和清除致病微生物，使其数量减少到不再能引起人发病。灭菌不仅要求杀灭或/和清除致病微生物，还要求将所有微生物全部杀灭或/和清除掉，包括非致病微生物。2.两者选用的处理方法不同：灭菌与消毒相比，要求更高，处理更难。灭菌必须选用能杀灭抵抗力最强的微生物(细菌芽胞)的物理方法或化学灭菌剂，而消毒只需选用具有一定杀菌效力的物理方法、化学消毒剂或生物消毒剂。3.应用的场所与处理的物品也不同：灭菌主要用于处理医院中进入人体无菌组织器官的诊疗用品和需要灭菌的工业产品，消毒用于处理日常生活和工作场所的物品，也用于医院中一般场所与物品的处理。（二）消毒与灭菌的区别三、消毒与灭菌1.抑菌剂(bacteriostaticagent)：能抑制微生物生长的物质。抑菌剂不能杀死细菌，但可以通过抑制细菌的生长，阻止细菌滋生过多、危害健康。2.消毒剂（disinfectant）：

通常是指能有效地控制或杀死水系统中的微生物--细菌、真菌和藻类的化学制剂。其作用机制通常是不可逆的与靶细胞进行紧密的结合，使其生长不可恢复。3.溶菌剂(bacteriolysis)：能通过使细胞裂解的方式杀死微生物，这类物质能通过抑制细胞壁合成或损伤细胞膜的方式使细菌溶解，将这类物质加入到生长的细胞悬液后会导致细胞数量减少、细胞悬液浊度降低、透明度增加。（三）控制微生物的化学方法三、消毒与灭菌4.抗代谢物（antimetabolite）：

微生物生长过程通常需要一些生长因子，在微生物生长液中加入生长因子的结构类似物可以竞争结合其靶位点，干扰微生物的正常代谢，以达到抑制微生物生长的目的。（三）控制微生物的化学方法叶酸的结构三、消毒与灭菌1.高温灭菌法：

用超过微生物承受的最高温度来杀灭微生物的方法称为高温灭菌法。主要包括干热和湿热两种方法。（1）干热灭菌法：

①烧灼：属于高温短时杀菌，利用高温使微生物的蛋白质及酶发生凝固或变性而死亡。这是应用最广泛而有效的灭菌方法，主要用于手术器械和物品的灭菌。②干烤：用干热灭菌箱（多采用机械对流型烤箱）进行灭菌。灭菌条件为：160℃维持2小时；170℃维持1小时；l80℃维持30分钟；高温下可达灭菌要求。适用于易被湿热损坏和在干燥条件下使用更方便的物品（如金属、玻璃、陶瓷及凡士林纱布条等）灭菌。（四）控制微生物的物理方法三、消毒与灭菌1.高温灭菌法（2）湿热灭菌法：是指以高温高压水蒸气为介质，用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法。由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌法可分为：高压蒸汽灭菌法、间歇蒸汽灭菌法、巴氏消毒法、煮沸灭菌法和流通蒸汽灭菌法。（四）控制微生物的物理方法三、消毒与灭菌2.辐射灭菌法包括γ射线、X射线和加速电子等，对各种微生物均有致死作用，细菌繁殖体对射线比芽胞要敏感。其机制是直接或者通过产生游离基，破坏DNA分子的共价键。3.紫外灭菌法：

波长在200nm～300nm的紫外线具有杀菌作用，以250nm～260nm最强，与嘌呤和嘧啶的吸收光谱高峰一致。紫外线可使DNA链上相邻的两个胸腺嘧啶共价结合而形成二聚体，干扰DNA正常转录，导致微生物的变异或死亡。但是由于紫外线穿透力较弱，普通玻璃、纸张、尘埃、水蒸汽等均能阻档紫外线，因此一般用于手术室、病房、实验室的空气消毒。（四）控制微生物的物理方法三、消毒与灭菌4.干燥灭菌法干燥可以使细菌脱水、盐类物质浓缩、蛋白质变性，而产生抑菌和杀菌的作用。5.过滤除菌法：

过滤除菌法主要用于血清、抗生素、维生素等不耐热也不能用化学方法除菌的生物制品及空气的除菌，但是不能除去病毒、支原体、衣原体等微生物。6.超声波灭菌法：超声波灭菌法是利用超声波的高频振动，引起溶液内瞬时真空状态，导致细胞裂解而达到灭菌效果的方法。（四）控制微生物的物理方法三、消毒与灭菌1.抗生素（antibiotic）：抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物，能抑制其他微生物生长或者杀死其他微生物。2.噬菌体（phage）：

噬菌体是病毒的一种，具有病毒的所有特性（个体微小；不具有完整细胞结构；只含有一种核酸）。其特别之处是专以细菌为宿主。噬菌体是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。（五）控制微生物的生物学方法三、消毒与灭菌四、培养基的成分与作用项目九常用培养基制备水既是细菌细胞的主要组成成分，又是细菌生长繁殖所必不可少的物质。水在细菌细胞中的主要生理功能有：①作为良好的溶剂，使营养物质溶解，利于细菌吸收；代谢产物的排泌也必须以水为介质才能完成。②作为良好的导体对细菌细胞温度调节起到很重要的作用。③维持蛋白、核酸等生物大分子天然构象的稳定和活性。④作为新陈代谢的重要媒介参与细菌细胞内一系列化学反应。（一）水四、培养基的成分与作用1.碳源是在细菌生长过程中为细菌提供碳元素来源的物质。碳源既是细菌合成蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶类等菌体成分的原料，又作为重要的能源物质为细菌提供生命活动所需的能量。2.氮源是指为细菌提供氮元素来源的物质。氮源一般不提供能量，主要为细菌提供合成菌体成分的原料，但是某些厌氧菌会在厌氧条件下分解氨基酸提供能量。（二）营养成分四、培养基的成分与作用3.无机盐细菌需要多种无机盐以提供其生长繁殖所需的各种元素，如磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁，以及微量元素钴、锌、锰、铜等。无机盐除构成菌体成分以外，其作用还有：①参与能量的储存和转运；②作为酶的辅基和酶激活剂，维持酶活性；③调节菌体内外渗透压；④某些元素与细菌的致病作用有关。4.生长因子生长因子是指某些细菌生长繁殖所必需的、自身不能合成或者合成量很小且不能满足自身生长需要的、必须由生长环境提供的有机化合物，如维生素、嘌呤、嘧啶、氨基酸等。（二）营养成分四、培养基的成分与作用5.微量元素微生物的生长过程中还需要一些微量元素。微量元素通常指的是对微生物生长起重要作用，但是需求量极其微小，通常在10-8~10-6mol/L（这里指的是在培养基中的浓度）。根据不同种类的细菌对营养物质的要求不同，可将细菌分成两类：①非苛养菌②苛养菌（二）营养成分四、培养基的成分与作用凝固剂指的是能使液体发生凝固的物质，最常用的为琼脂，特殊情况下还可以使用明胶、硅胶、卵蛋白及血清。一般配制液体培养基时不需要添加凝固剂。（三）凝固剂四、培养基的成分与作用（四）指示剂（五）抑制剂为观察细菌是否充分利用培养基中的营养物质，通常会加入一些指示剂，如酚红、溴甲酚紫等酸碱指示剂，以及亚甲基蓝等氧化还原指示剂。为促进目的菌生长，需在培养基中加入某种化学物质，有选择的抑制某些非目的菌生长，如抗生素、亚硫酸钠等物质。五、培养基的种类和用途项目九常用培养基制备1.天然培养基：由天然物质制成，化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，培养效果好，常用的天然培养基包括牛肉浸膏、蛋白胨、酵母浸膏、玉米粉、牛奶、血清等。2.合成培养基：合成培养基是由成分完全已知的各种化学物质配制而成的培养基，也称化学限定培养基。3.半合成培养基：在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分（一）按照培养基的成分来分五、培养基的种类和用途1.液体培养基：液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，生长速度快，代谢旺盛，适于作生理等研究、增菌培养、纯培养后观察细菌的生长现象，也常用于发酵工业。2.固体培养基：是在培养基中加入凝固剂，如2%~3%琼脂、明胶、硅胶等，融化待冷却后即为固体。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数、药敏试验和菌种保存等方面。3.半固体培养基：是在液体培养基中加入少量凝固剂，通常是0.2%~0.5%琼脂，琼脂融化冷却后呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、菌种鉴定及噬菌体效价滴定等方面。（二）按照培养基的物理性状来分五、培养基的种类和用途（三）按照微生物的种类来分五、培养基的种类和用途细菌培养基放线菌培养基酵母菌培养基霉菌培养基1.基础培养基：

基础培养基是