大学考研笔记教案基因工程电子教案

教案课程：基因工程学时：30学时班级：植保、农学、园艺教师：黑龙江八一农垦大学《基因工程》电子教案一、教学进度计划教学进度表周次学时教学内容备注12绪论22DNA的组成、结构32天然DNA的制备、限制性核酸内切酶及DNA的片段化42特异性DNA片段的PCR扩增52DNA片段的化学合成及凝胶电泳检测62分子克隆的载体及质粒克隆的载体72病毒（噬菌体）克隆载体及染色体定位整合克隆载体82人工染色体克隆载体及特殊用途克隆载体92目的基因、目的基因的制备及目的基因的分离102受体细胞及重组DNA分子转入原核生物112重组子的筛选122基因表达的机制132基因表达的调控元件及外源基因表达系统（前部分）142外源基因表达系统（后部分）及基因表达产物的检测与分离纯化152基因工程应用二、授课内容及学时分配授课内容及学时分配章节各章名称理论课周次理论课时数实验课时数总课时数1绪论212DNA重组883基因工程克隆的载体664目的基因的制备235目的基因导入受体细胞446外源基因的表达667基因工程的应用22合计3030三、单元教学计划名称第一章绪论目的要求使学生清晰基因工程的基本概念，知道基因工程的研究范围和内容，了解基因工程的诞生与发展状况。重点难点基因工程的含义、理论依据、研究的基本技术路线以及基因工程研究的内容。时间教学组织教学方法2学时一、引言1.基因工程含义1）广义含义2）狭义含义2.基因工程理论依据1）DNA分子的切割与连接2）核酸分子杂交3）凝胶电泳4）细胞转化5）DNA序列结构分析以及基因人工合成、基因定点突变和PCR扩增技术3.基因工程研究的基本技术路线1)从大大原核生物细胞中提取克隆的载体；2）从真核生物细胞中提取外源DNA；3）用限制性内切酶将载体打开，并用限制性内切酶消化真核生物DNA；4）用DNA连接酶将真核生物DNA片断接到载体上，获得重组体；5）用原核或真核生物细胞作为受体，使重组体进入并得至扩增，通过特定手段，能找到含有理想重组体的受体细胞。4.基因工程研究发展史1）50年代以前2）50年代以后3）最近20年二、基因工程研究内容1.从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤发，分离出带有目的基因的DNA片断。2.在体外将带有目的基因的外源DNA片断连接到能自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞，并与之一起增殖4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。5.从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。三、基因工程研究发展前景理论讲授；举例并借助课件进行辅助教学。名称第二章DNA重组目的要求使学生了解DNA的组成、结构和DNA的重组类型；理解DNA的浓缩及纯化，限制性核酸内切酶的特异性及作用机制，聚合酶链式反应技术的原理及其应用；掌握大肠杆菌质粒DNA的提取以及λ噬菌体DNA的提取，琼脂糖凝胶电泳的原理及方法，限制性内切酶的反应系统；E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶的连接机理。重点难点天然DNA的提取，限制性核酸内切酶和连接酶的作用机理及方法，PCR扩增DNA片段的基本原理和方法，琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法。DNA的纯化与浓缩，DNA片段的化学合成，DNA片段的连接。时间教学组织教学方法8学时第一节DNA的组成和结构一、DNA的组成.1．组成元素2．基本单位3．化学结构二、DNA的空间结构规则的双螺旋结构1．空间结构A－DNA的结构B－DNA的结构2．碱基互补配对原则3．DNA分子的特点三、DNA复制起始位点和复制子的结构1．复制的基本机理2．复制起始位点3．复制子及复制子的结构4．复制的特点四、DNA的转录启动子的定义启动子启动子的基本结构转录所需酶的种类2．转录转录区的结构转录的过程第二节天然DNA的制备一、天然DNA的来源和用途.1．天然DNA的来源2．天然DNA的用途二、天然DNA的提取天然DNA的提取方法与原理三、DNA的纯化四、DNA的浓缩DNA浓度的测定方法第三节限制性核酸内切酶和DNA片段化一、限制性核酸内切酶定义功能二、限制性核酸内切酶的类型及作用机制限制性核酸内切酶的类型2．限制性核酸内切酶的作用机制三、限制性核酸内切酶命名规则及识别序列限制性核酸内切酶的命名规则2．限制性核酸内切酶的识别序列四、限制性核酸内切酶切割DNA的位点五、限制性核酸内切酶反应系统第四节特异性DNA片段的PCR扩增一、PCR基本原理PCR扩增的定义PCR扩增的基本原理二、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件1．模板核酸2．引物3．缓冲液4．Mg2+5．三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）6．耐热DNA聚合酶7．温度循环参数1）变性温度与时间2）复性温度与时间3）延伸温度与时间4）循环数三、PCR扩增DNA片段的方法1．试剂1）引物2）耐热的DNA聚合酶3）10×PCR缓冲液4）5mmol/LdNTP贮备液5）DNA模板2．基本反应步骤PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成1）模板DNA的变性2）模板DNA与引物的退火(复性)3）引物的延伸四、常用的DNA片段PCR扩增系统1．兼并引物（DegeneratePrimer）PCR2．套式引物（NestedPrimer）PCR3．复合PCR（MultiplexPCR）4．反向PCR（InversePCR或ReversePCR）5．不对称PCR（AsymmetricPCR）6．标记PCR（LP-PCR）和彩色PCR7．加端PCR8．锚定PCR或固定PCRDNA片段的化学合成一、苷酸片段的化学合成方法1．原位合成2．直接点样二、化学方法合成的DNA片段1．历史2．基本原理3．基本原料4．合成步骤DNA片段大小的凝胶电泳检测一、实验室中常用的电泳参数1.琼脂糖凝胶电泳参数2.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数3.脉冲场凝胶电泳参数二、DNA片段的连接及重组类型1．DNA重组的概念及作用2．DNA片段的连接重组3．DNA连接酶4．DNA片段之间的连接5．DNA重组类型以理论讲授为主；配合课件进行讲授为辅；名称第三章基因克隆的载体目的要求使学生了解与构建克隆载体相关的质粒和λ噬菌体的性质；启动子探针型克隆载体和诱导型表达克隆载体等特殊用途的克隆载体。掌握大肠杆菌质粒克隆载体pBR322的构建。熟练掌握构建λ噬菌体克隆载体的基本策略，并了解其应用。重点难点大肠杆菌质粒克隆载体pBR322的构建。构建λ噬菌体克隆载体的基本策略及其应用。时间教学组织教学方法6学时引言一、分子克隆的载体1．载体的定义2．作为载体应该具备的基本条件第一节质粒克隆载体一、质粒定义与构型1．定义2．构型二、质粒克隆载体的特性具有独立复制起点2．具有较小的相对分子质量3．具有较高拷贝数4．具有选择性标记5．易于导入细胞6．具有安全性三、构建质粒克隆载体时预处理的主要问题、基本策略和具体实例1．构建一种质粒载体时预处理的主要问题2．质粒克隆载体构建的基本策略3．以常用的pBR322为例说明载体构建的步骤1）pBR322的定义2)pBR322质粒载体的特点3）pBR322质粒载体构建的步骤4）pBR322质粒载体的优点第二节病毒（噬菌体）克隆载体一、λ噬菌体克隆载体1．关于λ噬菌体的简介2．λ噬菌体的构建二、cosmid克隆载体1．cosmid克隆载体的特征2．cosmid克隆载体的构建三、M13噬菌体克隆载体1．M13DNA2．M13DNA的复制和M13噬菌体的增殖3．构建M13噬茵体克隆载体的策略和途径4．M13克隆载体的应用四、SV40克隆载体1．SV40－DNA的复制和SV40的增殖2．构建SV40克隆载体的基本策略和途径1）取代型克隆载体2）病毒－质粒重组克隆载体。五、反转录病毒克隆载体1．定义2．劳斯肉瘤病毒的生物学特性3．构建RSV反转录病毒克隆载体的策略和途径第三节染色体定位整合克隆载体一、定位整合克隆载体的几种模式1．内源平台双交换置换克隆载体2．外源平台双交换置换克隆载体3．内源平台双交换插入克隆载体4．内源平台单交换插入克隆载体二、定位整合克隆载体1．植物染色体定位整合克隆载体2．动物染色体定位整合克隆载休第四节人工染色体克隆载体一、人工染色体克隆载体的含义和特点含义特点二、人工染色体克隆载体的构建三、人工染色体克隆载体的应用1．构建基因组文库2．基因治疗3．基因功能的鉴定第五节特殊用途克隆载体一、启动子探针型克隆载体1．启动子探针型克隆载体的定义2．类型和相应内含简介1）Kanr标记的启动子探针克隆载体。2）gfp标记的启动子探针克隆载体。3）hPh标记的启动于探针克隆载体。4）Kanr标记的自动子探针克隆载体。二、诱导型表达克隆载体1．诱导型表达克隆载体的定义2．类型和相应内含简介1）二价金属离子诱导表达克隆载体。2）干旱诱导表达克隆载体。3）红光诱导表达克降载体。三、反义表达克隆载体1．反义表达克隆载体2．类型及相应内含简介1）SOD基因反义表达更隆载体．2）NHE1基因反义表达克隆载体。采用引导式的教学讲授法，并辅助多媒体课件名称第四章目的基因的制备目的要求了解原核细胞和真核细胞的基因组成，理解基因组文库、cDNA基因文库的概念，掌握cDNA基因文库的构建及目的基因的分离，并能利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因。重点难点cDNA基因文库的构建及目的基因的分离；利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因，基因组文库的构建以及筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术。时间教学组织教学方法2学时第一节目的基因及目的基因的制备一、基本概念及组成1．目的基因2．结构基因的组成3．原核生物基因的组成4．真核生物基因的组成5．其它基因的组成二、直接分离法1．限制性核酸内切酶酶切分离法2．双抗体免疫法分离编码蛋白的基因3．利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因三、构建基因组文库分离法四、cDNA基因文库的构建及目的基因分离五、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因六、基因的化学合成第二节目的基因的分离一、目的基因的功能克隆1.根据特异蛋白分离目的基因2.功能互补法克隆基因二、序列克隆法三、筛选目的基因片段的差别杂交及减法杂交技术四、利用差示分析法分离目的基因克隆五、功能结合法筛选目的基因六、DNA插入诱变法分离目的基因采用引导式的教学讲授法，并辅助多媒体课件名称第五章目的基因导入受体细胞目的要求理解受体细胞、转化、转导、感受态细胞、转化率、体外包装等相关概念；掌握感受态细胞的制备方法，核酸分子杂交检测法来筛选重组子，重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌；了解重组DNA分子转入真核细胞。重点难点感受态细胞的制备，重组质粒DNA分子转化大肠杆菌，重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌，核酸分子杂交检测法。时间教学组织教学方法4学时第一节受体细胞一、原核生物细胞1．原核生物细胞成为理想受体细胞类型的原因？2．为什么说有为数不少的真核生物基因不能在大肠杆菌中表达出具有生物活性的功能蛋白？二、真菌细胞1．为什么说酵母菌是最理想的真菌受体细胞？三、植物细胞四、动物细胞第二节重组DNA分子转入原核生物一、重组质粒DNA分子转化大肠杆菌1．以革兰氏阳性细茵为例，细菌转化的一种可能基本步骤，即原生质体化假说。2.支持该假说的理由及证据二、重组入噬菌体DNA分子转导大肠杆菌1．体外包装2．入噬菌体DNA体外包装的主要过程三、受体细胞的选择1．受体细胞的选择依据四、重组DNA分子转入真核细胞1．重组DNA分子转入植物细胞农杆菌介导的Ti质粒载体转化法2．重组DNA分子导入哺乳动物细胞第三节重组子的筛选一、遗传表型直接筛选法1．根据载体选择标记初步筛选转化子1）抗药性筛选2）插入失活筛选法3）插入表达筛选法4）显色互补筛选法5）利用报告基因筛选植物转化细胞6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞2.依赖于重组子结构特征分析的筛选法二、核酸分子杂交检测法三、免疫化学检测法四、转译筛选法采用启发式与问答式相结合的教学方法，并通过网络查阅相关的文献资料使教学内容不段创新。名称第六章外源基因的表达目的要求理解启动子、增强子、终止子、衰减子、绝缘子、反义子等概念；掌握外源基因在大肠杆菌基因表达系统中的表达形式、酵母表达系统中酵母基因表达载体即其种类、免疫学检测法，而在基因表达产物的分离纯化上只掌握柱层析法；对芽孢杆菌表达系统和链霉菌表达系统等原核生物基因表达系统仅作了解。重点难点基因表达的机制，外源基因表达系统，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统；基因表达的调控序列；酵母基因表达载体，哺乳动物基因表达载体。时间教学组织教学方法6学时第一节基因表达的机制一、外源基因的起始转录二、mRNA的延伸与稳定性三、外源基因mRNA的有效翻译四、表达蛋白在细胞中的稳定性五、目的基因沉默第二节基因表达的调控元件一、启动子二、增强子三、终止子四、衰减子五、绝缘子六、反义子第三节外源基因表达系统一、大肠杆菌基因表达系统二、芽孢杆菌表达系统三、链霉菌表达系统四、蓝藻表达系统五、酵母表达系统六、哺乳动物细胞基因表达系统七、植物细胞基因表达系统第四节基因表达产物的检测与分离纯化一、基因表达产物的检测二、基因表达产物的分离纯化采用启发式与问答式相结合的教学方法，并通过网络查阅相关的文献资料使教学内容不段创新。名称第七章基因工程应用目的要求了解基因工程在制药工业上、动物、植物等方面的应用；了解基因工程疫苗、肿瘤的基因治疗。重点难点基因工程疫苗的制备，肿瘤的基因治疗时间教学组织教学方法2学时一、基因工程药物1.基因工程激素类药物2.基因工程细胞因子类药物3.基因工程抗体4.基因工程受体5.基因工程疫苗二、转基因植物1.抗病虫害转基因植物2.抗逆转基因植物3.药用转基因植物4.转基因植物食品三、转基因动物1.利用转基因动物改良动物品种2.转基因动物作为生物反应器3.转基因动物筛选药物4.转基因动物应用于人体器官移植四、基因治疗1.肿瘤的基因治疗2.分子遗传病的基因治疗3.心血管病的基因治疗4.艾滋病的基因治疗五、基因芯片1.基因芯片原理及技术2.基因芯片的应用采用启发式与问答式相结合的教学方法，并通过网络查阅相关的文献资料使教学内容不段创新。四、教案内容课目第一章绪论目的要求使学生清晰基因工程的基本概念，知道基因工程的研究范围和内容，了解基因工程的诞生与发展状况。重点难点基因工程的含义、理论依据、研究的基本技术路线以及基因工程研究的内容。主要内容一、引言1.基因工程含义1）广义含义：是指包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。2）狭义含义：所谓的基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒和其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定的繁殖。2.基因工程理论依据（每一点只讲概要）1）DNA分子的切割与连接2）核酸分子杂交3）凝胶电泳4）细胞转化5）DNA序列结构分析以及基因人工合成、基因定点突变和PCR扩增技术3.基因工程研究的基本技术路线1)从大大原核生物细胞中提取克隆的载体；2）从真核生物细胞中提取外源DNA；3）用限制性内切酶将载体打开，并用限制性内切酶消化真核生物DNA；4）用DNA连接酶将真核生物DNA片断接到载体上，获得重组体；5）用原核或真核生物细胞作为受体，使重组体进入并得至扩增，通过特定手段，能找到含有理想重组体的受体细胞。4.基因工程研究发展史1）50年代以前主要从细胞染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段；2）50年代以后则主要从DNA大分子水平上进行研究，属于基因的分子生物学阶段；3）最近20年由于重组DNA技术的完善和应用，人们已经改变了从表型到基因型的传统研究基因的途径，而能够直接从克隆目的基因出发，研究基因的功能及其与表型间的关系，使基因的研究进入了反向生物学阶段。二、基因工程研究内容1.从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤发，分离出带有目的基因的DNA片断。2.在体外将带有目的基因的外源DNA片断连接到能自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞，并与之一起增殖4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。5.从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。三、基因工程研究发展前景1.阐明了基因是遗传信息的载体，没有基因也就没有生命。2.关于基因组核苷酸全序列的测定与分析，是重组DNA技术促进基础生物学研究的又一出色的范例。3.1984年美国科学家首先提出了研究人类基因组的设想。4.我国自1992年开始执行的《水稻基因组作图和测序计划》也已经取得了良好的进展。5.转基因动物的一种潜在的利用是，有可能将它作为专门生产一些特殊药物的“生物工厂”（bio-factories）。课目第二讲DNA的组成、结构目的要求使学生了解DNA的组成、结构；理解DNA的转录与复制，掌握复制的机理，复制子、启动子的结构和定义。重点难点复制的机理，复制子、启动子的结构和定义。Z-DNA结构的生物学意义。主要内容第一节DNA的组成和结构一、DNA的组成.1．组成元素：C、H、O、N、P2．基本单位：脱氧核苷酸（4种）3．化学结构：脱氧核苷酸链二、DNA的空间结构（一）、空间结构1）规则的双螺旋结构a.两条反式平行的多核苷酸链围绕同一中心轴相互缠绕b.嘌呤和嘧啶碱位于比螺旋的内侧。c.双螺旋的平均直径为2nm，两个相邻的碱基对之间相距的高度，即碱基堆积距离为0.34nm,两个核苷酸这间的夹角为36〇。d.两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键相连系而结合在一起。2）A－DNA的结构A-DNA也是由反向的两条多核苷酸链组成的双螺旋，也为右手螺旋，但是螺体较宽而短，碱基对与中轴这倾角也不同，呈19〇。3）Z－DNA的结构a.定义：在CGCGCG晶体中，磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈Z字形，所以呈它为Z－DNA。Z－DNA只有一条大沟，而无小沟。b.生物学意义：应当指出Z－DNA的形成通常在热力学上是不利的。因为Z－DNA中带负电荷的磷酸根距离太近了，这会产生静电排斥。但是，DNA链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。DNA解螺旋却是DNA复制和转录等过程中必要的环节，因此认为这一结构与基因调节有关。比如SV40增强子区中就有此结构，又如鼠类微小病毒DNS复制区起始点附近有GC交替排列序列。此外，DNA螺旋上沟的特征在其信息表达过程中起关键作用。调控蛋白都是通过其分子上特定的氨基酸侧链与DNA双螺旋沟中的碱基对一侧的氢原子供体或受体相互作用，形成氢键从而识别DNA上的遗传信息的。大沟所带的遗传信息比小沟多。沟的宽窄和深浅也直接影响到调控蛋白质对DNA信息的识别。ZDNA中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白识别方式也发生变化。这些都暗示ZDNA的存在不仅仅是由于DNA中出现嘌呤一啶嘧交替排列之结果，也一定是在漫漫的进化长河中对DNA序列与结构不断调整与筛选的结果，有其内在而深刻的含意，只是人们还未充分认识而已。（二）、碱基互补配对原则：A－T，G－C（三）、DNA分子的特点：稳定性、特异性、多样性。三、DNA复制起始位点和复制子的结构1．复制的基本机理DNA由两条螺旋的多核苷酸链组成，两条链的碱基通过A:T和G:C之间的氢键联结在一起。在复制过程中首先两条链间的氢键破裂并使双链解旋和分开，然后以每条链为模板，按碱基互补配对原则(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。在此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代的DNA，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制(semiconservationreplication)。2．复制起始位点DNA复制在生物细胞中要从DNA分子上特定位置开始。这个特定的位置就称为复制起点(Originofreplication)，用ori表示。3．复制子及复制子的结构a.DNA复制从起点开始双向进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon)。b.在原核生物中，每个DNA分子上就有一个复制子;而在真核生物中，每个DNA分子有许多个复制子，每个复制子长约50-200kb。因此，真核细胞DNA的复制是由许多个复制子共同完成的。c.既然DNA复制不是随机的从DNA分子上的任何一点起始，而是从特定的区域开始，这说明复制起点有其结构上的特殊性。分子遗传学者们利用分子克隆技术，分离出大肠杆菌染色体DNA复制起点oriC。它由422bp的DNA片段组成，其核苷酸序列已经搞清。其结构特点该为(1)在oriC区域内有一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构(palindrome)，这表明区域与复制酶系统的识别有关(2)在oriC区中还有两个转录启动区(启动子)的核苷酸序列，这暗示了转录可能在大肠杆菌染色体DNA复制起始着重的作用。目前已有许多实验表明转录确实是复制的起始所必需的，但具体的作用机制尚不清楚。4．复制的特点a.DNA复制的最主要特点是半保留复制，b.它还是半不连续复制(Semi-ondisctinuousreplication)。DNA双螺旋的两条链是反向平行的，因此，在复制起点处两条DNA链解开成单链时，一条是5'→3'方向，另一条是3'→5'方向。以这两条链为模板时，新生链延伸方向一条为3'→5'，另一条为5'→3'。但生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化5'→3'延伸，这是一个矛盾。冈崎片段(Okaxakifragments)的发现使这个矛盾得以解决。在复制起点两条链解开形成复制泡(replicationbubbles)，DNA向两侧复制形成两个复制叉(replicationforks)。以复制叉移动的方向为基准，一条模板链是3'→5'，以此为模板而进行的新生DNA链的合成沿5'→3'方向连续进行，这条链称为前导链(leadingstrand)。另一条模板链的方向为5'→'3'，以此为模板的DNA合成也是沿5'→3'方向进行，但与复制叉前进的方向相反，而且是分段，不连续合成的，这条链称为滞后链(laggingstrand)，合成的片段即为冈崎片段。这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物是普遍存在的，称为DNA合成的半不连续复制。四、DNA的转录1．启动子1）启动子的定义是指RNA聚合酶识别、结合并起动转录的DNA序列2）启动子的基本结构a.原核生物启动子的结构b.真核生物启动子的结构真核启动子一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长7-30bp。最常见的哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中的元件序列见表。表哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件元件名称共同序列结合的蛋白因子名称分子量结合DNA长度TATAboxTATAAAATBP30,00010bpGCboxGGGCGGSP-1105,00020bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,00022bpOctamerATTTGCATOct-176,00020bpOct-253,00023bpBGGGACTTTCCNFB44,00010bpATFGTGACGTAFT?20bp启动子中的元件可以分为两种①核心启动子元件(corepromoterelement)指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处的TATA盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。②游启动子元件(upstreampromoterelements)包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。这些元件与相应的蛋白因子结合能提高或改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，就使得不同的基因表达分别有不同的调控。2．转录1）转录所需酶的种类和性质a.原核生物的RNA聚合酶类该酶由五个亚基（αββ’ωσ）组成。α亚基分子量为65000亚基数目2功能与启动子结合β亚基分子量为155000亚基数目1功能含催化部位，起催化作用β’亚基分子量为51000亚基数目1功能与DNA结合ω亚基分子量为11000亚基数目1σ亚基分子量为70000亚基数目1功能识别起始位点b.真核生物的RNA聚合酶类真核生物的RNA聚合酶类及性质2）转录区的结构3）转录的过程：起始、延长和终止课目第三讲天然DNA的制备、限制性核酸内切酶及DNA的片段化目的要求理解DNA的纯化，掌握大肠杆菌质粒DNA的提取以及λ噬菌体DNA的提取。熟练掌握限制性核酸内切酶的类型、命名规则、识别序列和DNA的切害位点以及反应系统。重点难点天然DNA的提取和纯化；大肠杆菌质粒DNA的提取以及λ噬菌体DNA的提取；限制性核酸内切酶的类型、识别序列和DNA的切害位点。主要内容第二节天然DNA的制备一、天然DNA的来源和用途.1.天然DNA的来源:大肠杆菌质粒以及λ噬菌体2．天然DNA的用途:主要用于体外操作DNA二、天然DNA的提取（一）、大肠杆菌质粒DNA的提取方法质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增等。简要方法如下：1．1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基。2．37℃3．取1.5ml菌体于Ep管，以10000rpm离心30s，弃上清液。4．加0.3ml溶液I充分混合。5．加入0.3ml溶液II(0.2mM/LNaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀。6．加入0.3m1预冷溶液III轻轻翻转混匀，置于室温不超过5min。7．以10，000rpm离心16min，取上清液于另一新Ep管8．加入1/2等体积的异丙醇。9．再以10，000rpm离心16min，弃上清。10．70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。11．待沉淀干燥后，溶于TE缓冲液或水中。（二）、λ噬菌体DNA提取λ噬菌体是最早使用的克隆载体，λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子，它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十kb的外源DNA。许多cDNA和基因组文库是以λ噬菌体作为克隆载体构建的。因此，在经文库筛选得到目的克隆后，我们常常需要利用λ噬菌体裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体DNA来开展进一步的工作。具体步提取骤如下：1.将上述裂解液转移至离心管，离心8000g×10min，去细菌碎片，取上清液。2.加RNaseA、DNaseI至1μg/ml，37℃3.加9.3gPEG8000，5.8gNaCl，摇匀至溶解，冰浴1hr或4℃4.4℃离心10000g×5.加2mlSM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量离心管，加20μl10%SDS，20μl0.5MEDTA，68℃6.加等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀，离心12000g×5min，取上层液到一新微量离心管，加等体积氯仿/异戊醇（24：1），混匀，离心12000g×5min。7.取上层液到一新微量离心管，加等体积异丙醇，混匀，-20℃1hr，4℃离心12000g8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×9.沉淀溶于20μlTE，-20℃DNA的纯化DNA纯化的主要目的是回收得到纯的目的DNA片段，去除影响DNA连接酶活性的物质以及其它的DNA片段。纯化DNA片段的方法有多种，如：电洗脱法、从低熔点或普通琼脂糖凝胶中回收、玻璃珠纯化、柱层析以及硅胶吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接从PCR产物中或琼脂糖凝胶中回收DNA片段的试剂盒，有效地加快了DNA的纯化的速度。三、DNA纯化的基本步骤：1．从破坏的细胞壁和膜里释放出可溶性的高分子DNA2．通过变性或蛋白质分解使DNA和蛋白质的复合体解离3．将DNA从其他大分子中分离出来。第三节限制性核酸内切酶和DNA片段化一、限制性核酸内切酶1．定义：是指从核酸链中间水解3’，52．功能：在生物体内，限制性内切酶的主要功能是保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。在体外的基因操作中，可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。二、限制性核酸内切酶的类型及作用机制和切割DNA的位点1．限制性核酸内切酶的类型按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ类限制性核酸内切酶由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。Ⅱ类限制性核酸内切酶与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。Ⅲ类限制性核酸内切酶只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。制性核酸内切酶的作用机制每种限制酶识别和切割的通常为4-6个核苷酸序列,称为限制性位点(restrictionsites)或切点.限制酶切割双链DNA的方式有两种，产生的末端也有两种：第一种是交错切割，即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱基，故断口产生两小段自身互补的单链，这种末端容易互补连接，称为粘性末端（cohesiveterminus）(图13－1)；第二种为平整切割，即两条链在同一水平切开，得到平齐末端（bluntterminus）(图13－2)。由于具有相同粘性末端的DNA片段在DNA连接酶的作用下很容易共价连接，因此被广泛地应用于重组DNA操作中。具有相同平齐末端的DNA片段也可以连接，但连接效率只有粘性末端连接效率的1％。12图13－2限制酶的两类切割方式大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3①产生3’5’…G↓AATTC…3’→5’…3’…CATAA↑G…5’EooPⅠ3'…CTTAAOHpG②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ5’…CTGCA↓G…3’→5’…3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ3’…③产生平末端（bluntend）:NruⅠ为例：5’…TCG↓CGA…3’→5’…3’…AGC↑GCT…5’NruⅠ3’…三、限制性核酸内切酶命名规则及识别序列1．限制性核酸内切酶的命名规则限制酶根据其来源命名。例如，限制酶EcoRⅠ来源于大杆菌E.coli的RY13菌株,Ⅰ指在该菌株中分离的第一个限制酶。具体情况如下图所示。2．限制性核酸内切酶的识别序列下面是一些最常用的限制酶的来源及其识别顺序名称识别序列来源AvaC↓(C)CG(A)GTGAnabaenavariabilisBamHG↓GATCCBacillusamyloliquefaciensHBglⅡA↓GATCTBacillusglobigiiEcoRⅠG↓*ATTCAEscherichiacoliRY13EcoRⅡ↓CC(AGGTEscherichiacoliR245HaeⅢGG↓*CCHaemophilusaegyptiusHindⅢ*↓AGCTTAHemophilusinfluenzaeRdHpaⅠGTT↓AACHaemophilusparainfluenzaeHpaⅡC↓*GGC同上KpnⅠGGTAC↓CKlebsiellapneumoniaeMboⅠ↓GATCMoraxellabovisPstⅠCTGCA↓GProvidenciastuartii四、限制性核酸内切酶反应系统（一）、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。（二）、选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。（三）、酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。（四）、DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容。（五）、缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。（六）、反应体积内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。（七）、混合这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！（八）、反应温度大部分酶的反应温度为37°C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50（九）、反应时间1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。（十）、终止反应如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65°C或（十一）、贮存大部分酶应贮存于-20°C。少部分酶则须在-70°（十二）、稳定性每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20°C条件下十分稳定。高于（十三）、对照反应如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开。课目第四讲特异性DNA片段的PCR扩增目的要求要求学生熟练掌握PCR扩增的定义、基本原理、扩增DNA片断的基本条件、试剂、步骤和常用的DNA片段PCR扩增系统。重点难点PCR扩增的基本原理、扩增DNA片断的基本条件、试剂、步骤。主要内容第四节特异性DNA片段的PCR扩增一、PCR基本原理PCR扩增的定义聚合酶链反应（polymerasechainreaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。PCR扩增的基本原理PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在TaqDNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。二、PCR扩增特异性DNA片段的主要条件1．模板核酸：不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。2．引物：PCR结果的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的。3．缓冲液：PCR反应的缓冲液的目的是给TaqDNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。4．Mg2+：Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是TaqDNA聚合酶活性所必需的。5．三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。6．耐热DNA聚合酶：PCR之所以能得到广泛应用，主要是因为TaqDNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段。7．温度循环参数1）变性温度与时间：PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开，才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。2）复性温度与时间：变性温度是PCR反应成败的关键，复性温度决定着PCR的特异性。3）延伸温度与时间：引物延伸温度一般为72℃4）循环数：循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。三、PCR扩增DNA片段的方法1．试剂1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃3）10×PCR缓冲液：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃4）5mmol/LdNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。2．基本反应步骤PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃3）引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。四、常用的DNA片段PCR扩增系统1．兼并引物（DegeneratePrimer）PCR密码子具有兼并性，单以氨基酸顺序推测编码的DNA序列是不精确的，但可以设计成对兼并引物，扩增所有编码已知顺序的核酸序列。用兼并引物时寡核苷酸中核苷酸序列可以改变，但核苷酸的数量应相同。兼并度越低，产物特异性越强，设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3’2．套式引物（NestedPrimer）PCR用第一套引物扩增15～30个循环，再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增15～30个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增，而次级结构却很少扩增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子滤过器离心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用来分析中国仓鼠卵巢细胞AS52的分子突变。AS52细胞含有单拷贝的细胞gpt（guaninephos－phribosytransferase）基因，与哺乳动物具有同源性。套式引物PCR减少了引物非特异性退火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率。对环境样品中微生物检测和单拷贝的基因靶DNA的扩增是非常有效的。3．复合PCR（MultiplexPCR）用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法称为复合PCR。两种不同的军团菌（legionella）基因，一为特异嗜肺L基因（mip），另一种为L-5SrRNA基因，通过引物摇摆（staggered）添加进行复合PCR。首先mip引物PCR扩增7个循环，然后加入5SrRNA引物PCR扩增38个循环。加入不同量的LacZ和LacB基因引物进行PCR扩增可以检测大肠杆菌和与人类粪便污染有关的细菌包括E.coli大肠菌、肠源致病沙门氏菌和志贺氏菌。4．反向PCR（InversePCR或ReversePCR）反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’5．不对称PCR（AsymmetricPCR）不对称PCR的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA（ss-DNA）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：50～1：100，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于制备ss-DNA。也可用普通PCR制备靶DNA双链DNA（ds-DNA），再以ds-DNA为模板，只用其中一种过量引物进行单引物PCR制备ss-DNA。产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。不对称PCR主要为测序制备ss-DNA，尤为用cD－NA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。6．标记PCR（LP-PCR）和彩色PCRLP-PCR（LabelledPrimersPCR）是利用同位素、荧光素等对PCR引物5’7．加端PCR加端PCR（add-PCR）是使扩增产物的5’8．锚定PCR或固定PCR在聚丙烯管中可以对多种含膜板材料进行PCR，而在显微玻片上用组织细胞涂片或切片直接进行DNA扩增的方法就称为玻片PCR（Slide-PCR）。课目第五讲DNA片段的化学合成及凝胶电泳检测目的要求要求学生掌握核苷酸片段的合成方法，DNA片段的化学合成的原理、方法和原料；了解凝胶电泳检测DNA片段的技术参数，深刻理解DNA重组的概念、连接酶和重组类型。重点难点DNA片段的化学合成的原理、方法和原料；DNA重组的概念、连接酶和重组类型。主要内容DNA片段的化学合成一、核苷酸片段的化学合成方法1．原位合成：原位合成适用于寡核苷酸寡聚核苷酸原位合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5＇羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5＇端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。2．直接点样：直接点样既适用于大片段DNA，也适用于寡核苷酸，甚至mRNA。点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。采用的机器人有一套计算机控制三维移动装置；多个打印/喷印头；一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置；针洗涤装置。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯片上。真接打印时针头与芯片接触，而在喷印时针头与芯片保持一定距离。打印法的优点是探针密度高，通常1平方厘米可打印2,500个探针。缺点是定量准确性及重现性不好，打印针易堵塞且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长。缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有1平方厘米400点。国外有多家实验室和公司研究开发打印/喷印设备。二、化学方法合成的DNA片段1．历史1）寡核苷酸的化学合成起步于20世纪四十年代末。2）1955年，剑桥大学的Todd实验室成功合成了具有磷酸二酯键结构的TpT,并获得1957年诺贝尔奖。3）1965年，Khorana等利用化学方法大量合成脱氧核苷的单一聚合物或二种、三种脱氧核苷的重复序列，和人工合成的六十四种核糖三糖苷，研究蛋白质的生物合成过程，从而确定了氨基酸的三联密码子，因此而获得1968年诺贝尔奖。4）六十至七十年代，寡核苷酸的化学合成方法不断完善，逐渐形成了今天被广泛应用的固相亚磷酸三酯法并实现了合成的自动化。5）八十年代中后期，随着PCR技术的广泛应用，寡核苷酸的化学合成的应用几乎进入了每一个分子生物学实验室。是化学合成的寡核苷酸为PCR这一分子生物学及医学工作者的利器提供了刀锋。2．基本原理核酸分子的基本骨架是相邻核苷酸间的3’→5’磷酸二酯键，一个矛盾便是核苷酸为一个多官能基团的分子，且人工化学合成核酸分子必定是一个多步连续的反应，因此要求副反应尽可能的少，否则目的产物的产率以及纯化的难度会使合成失败。所以化学合成的基本过程便是在合成过程中尽可能的将不需要的基团暂时保护起来，在一轮缩合反应之后，再将上一轮基团上的保护基选择性的脱下来，以形成专一的磷酸二酯键。目前，一般DNA合成都采用固相亚磷酰胺三酯法。对此法的最简单描述是：溶液中的单体通过缩合反应形成3’3．基本原料1）支持物：固相合成是将核酸固定在固相载体上完成合成反应的，最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠（CPG，controlledporeglass），CPG的孔径根据所合成的寡核苷酸的长度而定，一般合成链长小于60nt时，选择孔径500埃，链长大于60nt时，使用1000埃CPG，使用CPG的缩合效率高达98%-99.9%，可以满足合成长达175nt的寡核苷酸的条件。2）单体：合成所用单体为核苷亚磷酰胺，是经过化学修饰的核苷酸，含下面几个功能基团。a.3’b.3’c.5’d.A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去；e.G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。4.合成步骤第一步----去封闭（Deblocking）,用三氯乙酸去除CPG所连核苷上的DMT,以暴露5’第二步----活化（Activation）,在缩合之前，单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’第三步----连接（Coupling），亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’第四步----盖帽（Capping）,为了防止未反应的与CPG相连的5’第五步----氧化（Oxidation），连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应注意最后一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。循环上述一至五步，寡核苷酸链即可延伸至所需长度时即可完成。第六节DNA片段大小的凝胶电泳检测一、实验室中常用的电泳参数1.琼脂糖凝胶电泳参数2.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数3.脉冲场凝胶电泳参数二、DNA片段的连接及重组类型1．DNA重组的概念及作用1）概念：本质上是一个酶促生化过程，是指将外源目的基因片段通过DNA连接酶的的作用插入到质粒载体中的过程。DNA片段只有与载体重组并转入合适的宿主细胞中才能进行复制。2）此方法可以对单个基因的功能进行研究。结合PCR技术还可以应用于疾病诊断、合成具有商业意义的产品，如胰岛素、干扰素等。2．DNA片段的连接重组DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。3．DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。E.coliDNA连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。T4噬茵体DNA连接酶催4．DNA片段之间的连接1）连接:连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即12～5．DNA重组类型课目第六讲分子克隆的载体及质粒克隆的载体目的要求要求学生理解载体的概念和载体具备的条件，掌握质粒的定义，构型与特性，重点掌握质粒构建时预处理的主要问题和基本策略；同时要求学生以pBR322为例掌握质粒构建的方法。重点难点载体的概念和载体具备的条件，质粒的定义，构型与特性，质粒构建时预处理的主要问题和基本策略。主要内容引言一、分子克隆的载体1．载体的定义载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。2．作为载体应该具备的基本条件作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。第一节质粒克隆载体一、质粒定义与构型1．定义：质粒（plasmid）是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露的双链DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子。2．构型：在宿主细胞内，质粒一般以超螺旋共价闭环DNA分于（ccc-DNA）的形式存在。体外在理化因子作用下，质粒可以成为开环DNA分子（oc-DNA）和线形DNA分子(1－DNA)。在变性条件下，质粒可成为单链DNA分子（ssDNA）。二、质粒克隆载体的特性1．具有独立复制起点：这是质粒在宿主细胞中进行扩增的必要条件。2．具有较小的相对分子质量：质粒是染色体外DNA，通常由环形双链DNA构成，其分子大小约为1~200kb（注：1.5Kb≈1MD兆道尔顿，或：小：103KD；大：105KD；即具有相对较小的分子质量）。相对分子量小有利于DNA的分离和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超过15kb。3．具有较高拷贝数：每个细胞可含有10~200个拷贝的松弛型复制质粒。当加入蛋白质合成抑制剂(如氯霉素等)，还可大大增加细胞中质粒的拷贝数，每个细胞可含有高达数千个拷贝的质粒，使外源DNA得以大量扩增。4．具有选择性标记：如抗生素的抗性基因，便于对克隆基因的检测和筛选。5．易于导入细胞：质粒可通过转化或电穿孔等方法极易被导入细胞。6．具有安全性：作为载体的质粒不具有转移功能，防止带有外源DNA的重组质粒扩散至实验室外，以免造成危害。三、构建质粒克隆载体的基本策略1．构建一种质粒载体时预先考虑的主要问题1）应该了解载体上的基因位置、限制性内切酶的作用位点；2）在理想寄主中，载体应该容易繁殖，因而可以得到大理载体和DNA重组分子；3）载体应该包括一个可供选择的标记性状，从而可以区别含有载体的转化细胞和不具有载体的非转化细胞。4）质粒的分子量应尽可能的小；5）理想的载体还应该有另一个遗传标记基因，这个标记基因可以因一段外源DNA片断的插入而被钝化，导致表现型的改变，以区别具有DNA重组分子的细胞和不具有DNA重组体分子的细胞。6）在载体的上述两个标记基因中，应该最大限度的具有各种限制性内切酶的切割位点，而且这些酶的识别序列仅在载体上出现一次，以保证酶处理后，环状DNA只在一处被打开，为克隆不同种的限制性片断提供了最大的可能性。2．质粒克隆载体构建的基本策略1)构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受体细胞中进行有效的复制．并且作为质粒克隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝数。2)构建的质粒克隆载体必须含有允许外源DNA片段克隆的位点，并且这样的克隆位点应尽可能多。3）构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆子的标记基因。一个质粒克隆载体最好有两种选择标记基因，并且在选择标记基因区内有合适的克隆位点。4）构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。5）根据特殊需耍．使构建的质粒克隆载体中组装各种“元件”（小DNA片断），构建成不同用途的质粒克隆载体。3．以常用的pBR322为例说明载体构建的步骤1）pBR322的定义pBR322是应用最广泛的质粒载体，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因，有许多种常用的限制酶的切点。它全长4352个核苷酸，排列顺序已全部测定。2)pBR322质粒载体的特点①可插入外源DNA大小为5kb左右，外源DNA若超过10kb，质粒在复制时就会变得不稳定。②它具有一个复制起点，是松弛型质粒，故细胞中具有较高的拷贝数，每个细胞含有20～30个拷贝。③pBR322还具有两种抗生素的抗性基因，一个是四环素抗性基因(Tetr)另一个是氨苄青霉素抗性基因(Ampr)。④外源DNA的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活(insertionalinactivation)。插入失活常被用于检测含有外源DNA的重组体，例如若在质粒pBR322的BamHI的位点插入外源DNA，然后转化大肠杆菌(Tets、Amps)。有重组质粒(即带有外源DNA的质粒)的宿主细胞失去对四环素的抗性，所以不能在含有四环素培养基的平板上生长，但仍能在含有氨苄青霉素培养基的平板上生长。而那些含有不带外源基因的质粒的宿主细胞，则可以在含有四环素或氨苄青霉素培养基的平板上生长，这样就很容易筛选到含有目的基因的细菌，从而淘汰不含目的基因的细菌。3）pBR322质粒载体构建的步骤4）pBR322质粒载体的特点课目第七讲病毒（噬菌体）克隆载体及染色体定位整合克隆载体目的要求要求学生掌握λ噬菌体克隆载体、反转录病毒克隆载体的定义；重点掌握λ噬菌体、cosmid克隆载体、M13噬菌体克隆载体、SV40克隆载体、反转录病毒克隆载体的构建策略和途径；同时要求学生了解性掌握定位整合克隆载体的4种模式与两种主要类型。重点难点λ噬菌体克隆载体、反转录病毒克隆载体的定义，λ噬菌体、cosmid克隆载体、M13噬菌体克隆载体、SV40克隆载体、反转录病毒克隆载体的构建策略和途径。主要内容第二节病毒（噬菌体）克隆载体一、λ噬菌体克隆载体1．关于λ噬菌体的简介2．λ噬菌体的构建二、cosmid克隆载体1．cosmid克隆载体的特征2．cosmid克隆载体的构建三、M13噬菌体克隆载体1．M13DNA2．M13DNA的复制和M13噬菌体的增殖3．构建M13噬茵体克隆载体的策略和途径4．M13克隆载体的应用四、SV40克隆载体1．SV40－DNA的复制和SV40的增殖2．构建SV40克隆载体的基本策略和途径1）取代型克隆载体2）病毒－质粒重组克隆载体。五、反转录病毒克隆载体1．定义2．劳斯肉瘤病毒的生物学特性3．构建RSV反转录病毒克隆载体的策略和途径第三节染色体定位整合克隆载体一、定位整合克隆载体的几种模式1．内源平台双交换置换克隆载体2．外源平台双交换置换克隆载体3．内源平台双交换插入克隆载体4．内源平台单交换插入克隆载体二、定位整合克隆载体1．植物染色体定位整合克隆载体2．动物染色体定位整合克隆载休课目第八讲人工染色体克隆载体及特殊用途克隆载体目的要求要求学生重点掌握人工染色体克隆载体的含义、特点、构建和应用，一般性掌握启动子探针型克隆载体、诱导型表达克隆载体、反义表达克隆载体的含义，类型及相应内含简介。重点难点人工染色体克隆载体的含义、特点、构建和应用，启动子探针型克隆载体、诱导型表达克隆载体、反义表达克隆载体的含义，类型。主要内容第四节人工染色体克隆载体一、人工染色体克隆载体的含义和特点含义特点二、人工染色体克隆载体的构建三、人工染色体克隆载体的应用1．构建基因组文库2．基因治疗3．基因功能的鉴定第五节特殊用途克隆载体一、启动子探针型克隆载体1．启动子探针型克隆载体的定义2．类型和相应内含简介1）Kanr标记的启动子探针克隆载体。2）gfp标记的启动子探针克隆载体。3）hPh标记的启动于探针克隆载体。4）Kanr标记的自动子探针克隆载体。二、诱导型表达克隆载体1．诱导型表达克隆载体的定义2．类型和相应内含简介1）二价金属离子诱导表达克隆载体。2）干旱诱导表达克隆载体。3）红光诱导表达克降载体。三、反义表达克隆载体1．反义表达克隆载体2．类型及相应内含简介1）SOD基因反义表达更隆载体．2）NHE1基因反义表达克隆载体。课目第九讲目的基因、目的基因的制备及目的基因的分离目的要求了解原核细胞和真核细胞的基因组成；一般性掌握目的基因的概念和基因的化学合成；理解基因组文库和