DB32T-从业人员健康检查 第4部分：重要肠道传染病致病微生物检验方法

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h\t"标准文件_一级条标题,2,标准文件_附录一级条标题,2,"前言 II引言 III1范围 IV2规范性引用文件 IV3术语和定义 IV4原理（方法） V5设备与材料 V6培养基和试剂 VI7检验程序 VI8操作步骤 VII附录A（规范性）伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴荧光PCR检测反应体系及注意事项 13附录B（规范性）标本混合方案 15前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件是DB32/T4644《从业人员健康检查》的第4部分。DB32/T4644已经发布了以下部分：——第1部分：检查机构管理规范；——第2部分：健康检查技术规范。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江苏省卫生健康委员会提出。本文件由江苏省卫生标准化技术委员会归口。本文件起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京市疾病预防控制中心、徐州市疾病预防控制中心、赤峰众康生物科技有限公司。本文件主要起草人：霍翔、李晔、乔昕、王燕梅、马恺、徐光、朱宝立、韩磊、李亚波、郭宝福、苗升浩。引言从业人员健康检查是根据《中华人民共和国传染病防治法》《中华人民共和国食品安全法》《中华人民共和国药品管理法》《公共场所卫生管理条例》《生活饮用水卫生监督管理办法》《化妆品卫生管理条例》等法律法规所进行的从业前、从业期间的健康检查。DB32/T4644《从业人员健康检查》拟分为以下5个部分。——第1部分：检查机构管理规范；——第2部分：健康检查技术规范；——第3部分：质量控制规范；——第4部分：重要肠道传染病致病微生物检验方法；——第5部分：信息系统基本数据集。DB32/T4644的制定是对从业人员健康检查工作相关方面的国家标准、行业标准有力补充，为贯彻落实《“健康中国2030”规划纲要》，推进健康中国建设，提高人民健康水平，保障公众健康和公共卫生安全具有非常重要的意义。从业人员健康检查第4部分：重要肠道传染病致病微生物检验方法范围本标准规定了从业人员健康检查粪便标本（肛拭子）中伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴等重要肠道传染病致病微生物的检验方法。本标准适用于公共场所从业人员、食品生产和加工（食品生产）人员、食品流通和餐饮服务（食品经营）人员、饮用水生产、经营人员健康检查项目中，粪便标本（肛拭子）的伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴的检验。其他相关行业从业人员，如从事医疗卫生用品生产、经营人员以及化妆品生产人员等，健康检查项目中，粪便标本（肛拭子）的伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、志贺氏菌、霍乱弧菌和痢疾阿米巴检验可参照本标准执行。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS280 伤寒和副伤寒诊断标准WS287 细菌性和阿米巴性痢疾诊断标准WS289霍乱诊断标准术语和定义下列术语和定义适用于本文件。实时荧光PCRreal-timePCR实时荧光聚合酶链反应。Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时，所经历的循环数。缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid)FAM：6－羧基荧光素（6-carboxyfluorescein) VIC：琥珀酰亚胺酯CY5：磺酸基-CY5羧酸LDC：赖氨酸脱羧酶（LysineDecarboxylase)MAC：麦康凯琼脂（MacConkeyAgar)NB：营养肉汤（NutrientBroth)NP-40：乙基苯基聚乙二醇（NonidetP-40)SC：亚硒酸盐胱氨酸（SeleniteCystine)Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase)TSI：三糖铁琼脂（TripleSugarIronAgar)UNG酶：尿嘧啶DNA糖基酶（UracilDNAglycosylase)BS：亚硫酸铋琼脂XLD：木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（Xylose-LysineDesoxycholate)TCBS:硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂原理（方法）筛查试验依据核酸体外扩增基本原理，针对伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴特异靶基因序列设计引物、荧光标记探针，在PCR反应过程中，当荧光信号达到并超过所设定的阈值时，利用荧光信号强度与PCR产物量的正相关关系，即可对PCR结果进行分析和判定。对标本的模板DNA进行实时荧光PCR扩增，根据其Ct值及扩增曲线进行标本结果报告，当PCR结果呈阴性时直接报告阴性结果；当PCR结果呈阳性时，进一步对阳性标本做确诊实验。从而实现对从业人员健康检查粪便标本中的伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴的快速筛查。确证鉴定确证鉴定的基本原理，是通过增菌、分离、生化和血清学鉴定等方法，从PCR阳性标本中分离得到目标致病性微生物。确证鉴定结果为阳性时报告阳性（检出），为阴性时报告阴性（未检出）。设备与材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备材料如下生物安全柜。高速离心机（离心速度12000r/min以上）。涡旋混匀器。恒温培养箱。冰箱：2℃～8℃和-20℃电子天平：感量1mg。恒温金属浴／水浴锅：25℃～100℃。pH计或pH比色管或精pH试纸。微量可调移液器和配套带滤芯吸头：2.5µL、10µL、100µL、200µL、1000µL。采样管：密闭式，内径≥1.2cm，高度≥10cm。采样拭子：长度≥10cm。无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。无菌培养皿：直径90mm。无菌试管：3mm×50mm。无菌锥形瓶：容量500mL,250mL。实时荧光PCR仪。全自动微生物生化鉴定系统。培养基和试剂营养肉汤（NB）增菌液。亚硫酸铋（BS）琼脂。木糖赖氨酸脱氧胆酸（XLD）琼脂。沙门菌显色培养基。麦康凯琼脂（MAC）。三糖铁琼脂（TSI）。四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液。亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。克氏双糖铁琼脂（KIA）。糖发酵管。赖氨酸脱羧酶试验培养基（LDC）。动力-靛基质-尿素半固体琼脂。靛基质试剂。沙门菌属诊断血清。志贺菌属诊断血清。除特别说明外，PCR所用试剂为分析纯。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。DNA提取液：Tris-EDTA缓冲液（0.01mol/L,pH8.0）、0.01%NP40。实时荧光PCR检测试剂：伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴荧光PCR检测靶基因、反应体系及注意事项见附录A。碱性蛋白胨水培养基。庆大霉素琼脂。TCBS琼脂。四号琼脂。碱性营养琼脂。氧化酶试剂。霍乱弧菌诊断血清。检验程序从业人员健康检查重要肠道传染病致病微生物检验程序见图1。从业人员健康检查重要肠道传染病致病菌检验程序操作步骤标本采集、保存及运输标本采集用灭菌的采样拭子，由肛门插入直肠内3cm-5cm处，旋转360°采集，或用采样拭子蘸取粪便，放入盛有5-10mL营养肉汤增菌液的采样管内，旋紧管盖，编号备用。标本的保存和运输采集的标本尽快运送到实验室，如不能立即送检，在2℃-8℃条件下保存不超过24h。标本的前处理前增菌采集的肛拭子标本，需要在营养肉汤中置于36°C±1℃增菌培养3h-6h。标本混合模板DNA的制备标本12000r/min离心5min，弃尽上清；加入50µL-100µLDNA提取液，重悬沉淀并充分混合后100℃加热处理5min,12000r/min离心2min，取5µL上清液，作为模板DNA用于实时荧光PCR检测（制备好的裂解液需立即进行实时荧光PCR检测）。筛查试验（实时荧光PCR)试剂配制按照附录A配制伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴荧光PCR检测反应体系。实时荧光PCR快速检测过程防污染方法和措施按照WS/T230-2002第6章进行。分装体系制取的n管标本加上阳性对照和阴性对照各一管，按附录A体系要求分装反应液（20µL)。加样在标本处理区取n+2管（为待检混合管管数n+一管阳性对照+一管阴性对照）分装好反应液的PCR反应管。先瞬间离心10s，再将对应编号的PCR反应管加入5µL上清液，盖紧管盖，瞬间离心10s。荧光PCR检测在核酸扩增区进行。将8.3.3中离心后的PCR反应管放入实时荧光PCR仪内，记录标本摆放顺序，进行核酸扩增和检测。反应体系为25µL，其中PCR反应液（含有特异性引物、dNTP、探针及反应所需各种离子）19.64µL,UNG酶0.06µL(lU/µL),Taq酶0.3µL(5U/µL)，模板DNA5µL。荧光PCR检测的反应参数设置为：第一阶段，UNG酶处理50℃／2min,1个循环；第二阶段，预变性95℃／2min,1个循环；第三阶段，95℃／5s,60℃／30s,40个循环。在该阶段的60℃/30s采集FAM、VIC和CY5荧光信号。如用商品化实时荧光PCR试剂盒，应按照试剂盒说明书进行操作和结果判定。结果判断结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪声情况进行调整。质控标准阴性对照：Ct＞36或无Ct值，曲线为直线或轻微斜线，无明显指数增长期。阳性对照：Ct≤22，曲线有明显指数扩增期。如果阴性对照和阳性对照的荧光PCR检测结果不能满足以上条件，此次实验视为无效。结果判定和报告FAM通道Ct值＞36或无Ct值，可判定标本检测结果为伤寒沙门菌(A管)和（或）痢疾阿米巴(B管)阴性，可直接报告未检出伤寒沙门菌和（或）痢疾阿米巴；VIC通道Ct值＞36或无Ct值，可判定标本检测结果为副伤寒沙门菌(A管)阴性，可直接报告未检出副伤寒沙门菌；CY5通道Ct值＞36或无Ct值，可判定标本检测结果为霍乱弧菌(A管)和志贺氏菌(B管)阴性，可直接报告未检出霍乱弧菌和（或）志贺氏菌。FAM通道Ct值<33，有明显指数增长期，可判定该标本检测结果为伤寒沙门菌(A管)和（或）痢疾阿米巴(B管)；VIC通道Ct值<33，有明显指数增长期，可判定该标本检测结果为副伤寒沙门菌(A管)；CY5通道Ct值<33，有明显指数增长期，可判定该标本检测结果为霍乱弧菌(A管)和（或）志贺氏菌(B管)。如表1。FAMVICCY5A管伤寒沙门菌副伤寒沙门菌霍乱弧菌B管痢疾阿米巴/志贺氏菌FAM通道、VIC通道和（或）CY5通道33≤Ct值≤36，建议标本重新做荧光PCR检测。如果重新检测结果的Ct值≤36，曲线有明显指数增长期，则判定为相应病原体阳性，否则判定为阴性。PCR阳性混合标本确认对PCR结果为阳性的混合标本，依据8.5确诊试验做进一步的确认。确证鉴定增菌混合标本PCR检测结果为伤寒或副伤寒沙门氏菌阳性时，将标本分别接种于SC增菌液中36℃±1℃培养18h-24h,TTB增菌液中42℃±1℃培养18h-24h。混合标本PCR检测结果为志贺氏菌阳性时，无需增菌，将标本直接分离培养。混合标本PCR检测结果为霍乱弧菌阳性时，将标本接种于碱性蛋白胨水培养基中37℃增菌培养6h-8h。混合标本PCR检测结果为痢疾阿米巴阳性时，需重新采集病人粪便，按照WS287进行检验。分离培养伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌：按照GB4789.4进行检测。志贺氏菌：取前增菌液1环，划线接种于MAC或XLD琼脂平板，于36℃±1℃培养18h-24h，志贺氏菌呈现不发酵乳糖的菌落，见表2。志贺菌属在MAC和XLD琼脂平板上的菌落特征霍乱弧菌：取增菌液1环，划线接种于强、弱选择性培养基各一个置37℃培养18h～24h。强选择性培养基包括庆大霉素琼脂、TCBS琼脂和四号琼脂。弱选择性培养基一般使用碱性营养琼脂。霍乱弧菌在选择性培养基上的菌落特征见表3.霍乱弧菌在选择性培养基上的菌落特征选择性琼脂平板霍乱弧菌碱性营养琼脂无色、圆形、透明或半透明、表面光滑、润湿、扁平或和稍凸起、边缘整齐，菌落直径一般约为2mm。庆大霉素琼脂和四号琼脂与碱性营养琼脂上生长的菌落相似，但透明性略差，多呈半透明状，由于这类培养基均含有亚碲酸盐成分，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并随培养时间的延长而加深。TCBS琼脂黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐生化试验伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌按照GB4789.4进行检测。志贺氏菌按照WS287进行检测。可选择鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统。霍乱弧菌菌株初筛包括玻片凝集实验、氧化酶试验。玻片凝集实验a)从分离培养基上挑取疑似菌落接种于非选择性培养基进行纯培养(37℃18h～24h),取纯培养物与O1群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或O1群多价诊断血清及O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体或诊断血清做玻片凝集试验，进行O1群和O139群霍乱弧菌的初筛。b)玻片凝集试验使用的血清效价范围应为1:32～1:64。如玻片凝集试验在1min内出现肉眼可见的明显凝集块，但在生理盐水中不产生凝集的培养菌判为凝集阳性；应立即保存菌株做复核与分型鉴定；在1min内不出现凝集块者判为凝集阴性。c)生长在碱性营养琼脂、庆大霉素琼脂及四号琼脂上的疑似菌落如足够大，可直接挑取疑似菌落与O1群霍乱弧菌多价诊断血清及O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验进行初筛。但生长在TCBS培养基上的疑似菌落常因培养基中蔗糖的影响造成难于乳化，不能直接进行玻片凝集试验，应先以非选择性培养基纯培养后再作玻片凝集。d)要注意同一标本存在O1群和O139群等多个血清群霍乱弧菌混合的可能，每份标本至少挑选5个以上的疑似菌落逐一进行鉴定。氧化酶试验试验方法：取生长在非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的滤纸上，然后滴加氧化酶试剂，如培养物在1min～2min内出现粉红-紫红-紫蓝色，有的最后呈紫黑色，判断为氧化酶试验阳性；培养物不显色判为阴性。菌株复核经初筛阳性或可疑阳性的菌株，应该进行复核鉴定。复核结果符合O1群或O139群霍乱弧菌的菌株，按菌株管理的要求进行保存与上送；如复核结果出现疑问，应尽快将菌株上送参比实验室进行确认分析。菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：血清凝集试验与血清分型、革兰染色、黏丝试验、氧化酶试验、动力试验。霍乱弧菌系统生化鉴定详见表4。部分弧菌科细菌的系统生化鉴定注：部分O139群霍乱弧菌为抗性(R)可选择鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统。菌株鉴定根据以上伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、志贺氏菌的初步生化反应结果，依据GB4789.4和WS287做进一步菌株鉴定。血清学分型伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、志贺氏菌采用玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌血清分型按照GB4789.4进行检测。志贺氏菌血清分型按照WS287附录A.1进行检测。PCR检测结果为痢疾阿米巴阳性时，按照WS287附录A.2进行检测。结果报告根据确诊试验结果对实时荧光PCR阳性标本作出最终结果判定和菌型判定。

（规范性）

伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴荧光PCR检测反应体系及注意事项A.1 荧光PCR检测靶基因分别针对伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、霍乱弧菌、志贺氏菌和痢疾阿米巴的特异基因设计引物和探针，引物和探针序列见表A.l。伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌等病原体特异性引物和探针5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5’5