生物中图版学案：第一章第一节微生物的分离和纯培养

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精第一节微生物的分离和纯培养1．运用微生物培养技术，完成微生物的分离和培养。2．比较消毒与灭菌的区别及适用范围。3．举例说明常用的消毒与灭菌的方法。4．阐明接种的方法。一、培养基在进行微生物的分离和纯培养时，可根据微生物生长繁殖和代谢的需要,将各种营养物质混合在一起，配制成适合微生物生存的营养基质——培养基.将溶化后的固体培养基基质倒入无菌培养皿,冷却凝固后制成的培养基称为平板培养基。二、纯培养将所需的微生物从混杂的微生物群体中分离出来，获得纯种微生物，这个过程称为纯培养。这个过程中首先需要把相应的研究对象移入培养基中,这一过程称为接种。在平板培养基上接种的方法有平板划线法、稀释涂布平板法、稀释混合平板法等。实验中要根据实验目的、培养基种类和实验器皿的差异,采用不同的接种方法.划线的方法包括连续划线法和交叉划线法。连续划线法是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线.交叉划线法是从平板的一边作第一次平行划线若干条.转动培养皿约70°角，将接种环在火上灼烧并冷却后,通过第一次划线部分,作第二次平行划线。同法进行第三次、第四次划线.通过平板划线，聚集的多种微生物被分散到培养基的表面。在数次划线后，可以分离得到由一个细菌繁殖而来的菌落。三、无菌技术在实验过程中，要对所用的器材、培养基进行严格的灭菌,对工作场所进行消毒.灭菌是指用强烈的理化因素杀死环境或物体内外所有的微生物,常用的是高温灭菌法。而消毒一般是用相对温和的理化方法杀死环境或物体上的病原微生物和有害微生物的营养细胞，常用的是射线消毒法和化学药剂消毒法。思考：日常生活中的牛奶在进入市场销售前要进行消毒，可能采用哪种消毒方法呢？提示：用巴氏消毒法牛奶进行消毒，可以杀死牛奶中的微生物，而牛奶的营养成分不会被破坏。四、微生物培养条件微生物的生长繁殖还需要适宜的温度，一般是将接种后的培养基放入恒温培养箱中培养.不同的微生物,使用的培养基、培养温度和时间有所不同。大多数微生物适宜生长的温度在25～40℃之间,实验室中常采用28～30℃培养微生物。一般的细菌适合于中性环境生长，放线菌适合于偏碱性环境，而酵母菌和霉菌适合于微酸性环境，配制培养基时需要根据微生物的类群调节pH。1．培养基的成分与微生物生长所需的营养微生物细胞是由C、H、O、N、P、S以及其他元素组成，其中C、H、O、N占细胞干重的90%以上，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合物和有机化合物。这些化合物可以归纳成碳源、氮源、水、无机盐和生长因子五大类。因而,虽然培养不同微生物的具体培养基配方不同，但一般都要有这几类物质。下表为碳源、氮源与生长因子的相关知识。类别概念来源最常利用功能碳源能为微生物提供生长繁殖所需碳元素的营养物质无机碳源：CO2、NaHCO3等；有机碳源：糖类、脂肪酸等含碳有机物,花生粉饼、石油等天然物质糖类（葡萄糖）构成细胞物质和一些代谢产物,有些还是异氧微生物的主要能源物质，因此需要量最大氮源能为微生物提供所需氮元素的营养物质无机氮源：N2、氨、铵盐、硝酸盐等;有机氮源：尿素、牛肉膏和蛋白胨等铵盐、硝酸盐等合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物生长因子微生物生长不可缺少的微量有机物,包括维生素、氨基酸和碱基等一些天然物质，如酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等有的种类需要是酶和核酸的组成成分之所以要补充生长因子，往往是由于微生物缺乏合成这些物质所需的酶或合成能力有限。此外,在提供营养物质的基础上,培养基还需要满足微生物生长对pH以及氧气等的需求。如培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性，培养细菌时需将pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件.2．配制培养基的原则（1）目的要明确。要根据培养的微生物的种类、培养的目的等,选择原料。如自养微生物可以用无机物作碳源、氮源，而且不需要生长因子。(2）营养要协调.配制培养基时，必须注意各种营养物质的浓度和比例。如蔗糖是多种微生物的主要营养物质，但高浓度的蔗糖会抑制微生物的生长。其中碳源和氮源的比例最为重要。例如:碳氮比为4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。（3)pH要适宜。因为各种微生物适宜生长的pH范围不同。3．消毒与灭菌的比较理化因素的作用强度消灭微生物的范围芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和环境或物体上的病原微生物和有害微生物不能灭菌强烈环境或物体内外所有的微生物能无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。4．几种消毒和灭菌方法及其适用范围操作方法类型适用范围消毒方法煮沸消毒法日常生活常用100℃煮沸5~6min巴氏消毒法不耐高温的液体70～75℃煮30min或80℃煮15min化学药剂生物活体、水源等擦拭等，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线房间、仪器设备紫外线照射30min灭菌方法灼烧接种工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱，160～170℃加热1～2h高压蒸汽灭菌培养基、培养皿等，生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa，温度121℃，15～30min用巴氏消毒法对牛奶进行消毒，可以杀死牛奶中的微生物,而牛奶的营养成分不会被破坏；紫外线照射30min可以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前,适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果；对于那些培养基中需要、但加热会分解的化合物，如尿素、NaHCO3，不能使用高压蒸汽灭菌法。只能将其配成溶液，使用特定的器材单独过滤灭菌。5．平板划线法操作要点(1）在操作第一步、每次划线之前及划线操作结束时都要灼烧接种环.操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种,使下一次划线时,接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落.划线结束后灼烧接种环能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境或感染操作者。(2)在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线。以免接种环温度太高，杀死菌种。（3）在作第二次以及其后的划线操作时，要从上一次划线的末端开始划线。划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。6．对分离纯化效果的判断方法（1）培养时,要将接种后的培养基和一个未接种的培养基一同培养,未接种的培养基的作用是对照,若其表面有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底,需要重新进行实验。（2）如果对照培养基上无菌落形成，可观察接种后的培养基。如果培养基上大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽,边缘整齐,则说明接种成功；如果出现了其他颜色、形状的菌落，说明有杂菌,需要重新进行分离纯化.培养时间不同，菌落大小会不同，因为时间越长，菌落中细菌繁殖越多,菌落体积越大;菌落数可能会增多，但已有的菌落分布位置应相同。题型一微生物的营养【例题1】下列关于微生物的营养，说法正确的是（）.A．同一种物质不可能既作碳源又作氮源B．凡是碳源都能提供能量C．除水以外的无机物仅提供无机盐D．无机氮源也可能提供能量解析:对一些微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源,又是氮源。CO2是光能自养细菌的碳源,但不能提供能量。CO2和N2是无机物，也是微生物的碳源和氮源。硝化细菌所利用的氮源是无机氮源—-氨，同时氨也为硝化细菌提供用以化能合成作用的能源。答案:D反思领悟：含C、H、O、N的化合物既是一部分微生物的碳源，又是微生物的氮源;有机碳源能提供能量，无机碳源不能提供能量；无机物也可提供碳源、氮源和能源。题型二无菌操作相关技术【例题2】细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭下列哪些部位的杂菌？（）A．接种环、手、培养基B．高压锅、手、接种环C．培养基、手、接种环D．接种环、手、高压锅解析:高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环.答案：C反思领悟：微生物培养过程中的无菌操作包括消毒和灭菌两大类，分别又有各种不同的方法。对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒;将用于微生物培养的器皿、接种工具和培养基等器具进行灭菌.1要从细菌中分离出真菌，可用下列哪种培养基？()A．加入青霉素的培养基B．加入食盐的培养基C．加入蛋白胨的培养基D．无碳源培养基解析：青霉素可杀死细菌，真菌对其不敏感.答案：A2（多选）发酵工程的第一个重要工作是选择优良的单一纯种。消灭杂菌，获得纯种的方法包括（)。A．根据微生物对碳源需要的差别，使用不同